轉基因植物檢測技術研究進展

王慧遠，賈維薇，陳慶河

(1.南京市金陵中學　210005； 2.福建省農業科學院植物保護研究所)

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轉基因植物檢測技術研究進展

王慧遠1，賈維薇1，陳慶河2

(1.南京市金陵中學210005； 2.福建省農業科學院植物保護研究所)

摘要：對國內外轉基因植物及產品的檢測技術進行綜述，重點介紹目前使用較廣泛的PCR技術、酶聯免疫吸附技術、環介導等溫擴增技術、基因芯片技術及其他轉基因檢測技術的原理和特點，并展望今后轉基因檢測技術的發展趨勢和研究方向。

關鍵詞：轉基因植物；檢測技術；核酸；蛋白質

轉基因技術是指通過體外重組DNA技術將外源基因轉入到生物體的細胞或組織中，由于導入基因的表達引起生物體的性狀可遺傳性修飾，從而使再生生物體獲得新的遺傳特性。這一技術打破了生物的種間隔離，大大擴大了物種之間的基因交流范圍[1]。

自1983年首次報道植物的遺傳轉化以來，大批轉基因植物新品種不斷涌現，獲得了極大的經濟和社會效益。據國際農業生物技術應用服務組織(ISAAA)統計，2014年全球轉基因作物的種植面積為1.815億hm2[2]，這與1996年的1700萬hm2相比，增幅超過10倍。然而，隨著轉基因作物及其產品的大規模商業化，其安全性及對人類健康和生態環境的潛在威脅受到國際社會和廣大民眾的廣泛關注。轉基因生物需要進行安全評價, 而轉基因檢測技術是其研究和安全管理的基礎和技術保障。因此,研究轉基因動植物產品檢測技術,建立轉基因生物安全檢測技術體系, 成為目前亟待解決的關鍵問題。

目前轉基因檢測技術主要是基于核酸的檢測方法和基于外源蛋白靶標的檢測方法，如PCR法、酶聯免疫吸附法、生物傳感器、基因芯片等。這些方法在不同轉基因產品檢測應用中各有優缺點。本文重點綜述轉基因植物及產品檢測技術的研究進展，并展望今后轉基因檢測技術的發展趨勢和研究方向。

1基于核酸的檢測技術

1.1定性PCR檢測技術

聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是20世紀80年代中期由Mullis發展起來的體外核酸擴增技術，廣泛用于外源基因檢測、目的基因標記、功能基因分離和克隆等。該技術以極少量目標DNA為模板，加入目標基因特異性引物，在DNA聚合酶作用下，由高溫變性、低溫退火及適當溫度延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的 DNA片段得以迅速擴增。該技術可根據目的基因、標記基因序列設計PCR引物，從轉基因植株中擴增外源基因片段，而非轉基因植物基因組則不能擴增出相應的目標片段。目前，PCR技術被用于轉基因大豆[3]、轉基因小麥[4-6]、轉基因玉米[7]和轉基因油菜[8]等植物的檢測。

由于PCR檢測所需的DNA量少、純度要求不高、操作簡單、成本低、實驗安全，是目前轉基因檢測不可或缺的方法。但是，PCR檢測易出現假陽性結果。引物設計不合理，外源DNA插入后的重排或變異，靶序列或擴增產物的交叉污染等因素都會造成檢測的誤差。而且對于量少和受到嚴重破壞的核酸樣本，其DNA遭受比較嚴重的破壞，再加上轉基因DNA成分受到大幅度的稀釋，采用普通PCR技術往往難以檢測，因此提高PCR檢測靈敏度對準確標定食品是否含有轉基因成分尤為關鍵。在普通PCR基礎上發展而來的巢式和半巢式PCR(nested and semi-nested PCR)檢測技術，針對同一模板，利用2對引物，進行2次特異擴增，可顯著提高檢測的特異性和靈敏度，在轉基因檢測中得到了應用[9]。此外，由于商品化轉基因生物的種類不斷增加，所涉及的基因不斷增多，普通PCR檢測技術1次反應只能針對1個目標序列，難以滿足轉基因成分快速檢測的需求。多重PCR (multiplex PCR) 檢測技術能夠實現在同一個反應管里進行2對或2對以上的引物針對不同的DNA序列進行擴增，與普通PCR相比，具有提高檢測通量、節約模板和試劑、縮短檢測時間等優點，目前也已經被應用到轉基因檢測中[10-11]。

1.2定量PCR檢測技術

目前許多國家實行轉基因產品標識制度，規定轉基因成分的最低含量閾值，如日本、俄羅斯等國是5%，歐盟是0.9%[12]。因此，必需對轉基因產品進行定量檢測。目前已發展出以植物內源基因作參照的實時熒光定量PCR技術(RT-PCR)和數量競爭性PCR(QC-PCR)技術。

RT-PCR技術能實現核酸含量的定量檢測，基本原理是在PCR反應體系中加入熒光標記基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后利用標準曲線對待測模板進行定量檢測。根據所采用的熒光基團發光原理的不同，主要分為SYBR Green I熒光染料法和TaqMan探針法。RT-PCR 技術已成功應用于轉基因大豆、玉米和甜菜等作物轉基因成分的檢測，其檢測靈敏度可達0.01%以下[13]。白衛濱等[14]用RT-PCR技術成功檢測出美國、阿根廷、巴西和中國轉基因豆粉的轉基因成分，其靈敏度為0.001%。王小花等[15]利用RT-PCR方法監測大豆轉基因成分，檢測限為0.01%。RT-PCR具有重復性好、靈敏度高、核酸交叉污染少、易于自動化等優點，有效解決了傳統定量只能終點檢測的局限，但定量標準物研究還相對滯后，且對儀器設備要求較高，檢測費用昂貴。因此其普及應用在一定程度上受到制約。

QC-PCR是一種定量PCR，通過向PCR反應體系中加入人工構建的帶有突變的競爭模板，以控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對目的模板做定量研究。目前已建立對NOS終止子、CaMV35S啟動子、Roundup Ready大豆等轉基因作物的競爭性PCR檢測方法[16-17]。QC-PCR對實驗儀器要求不高，但需要用基因重組技術構建內標競爭DNA，而且要求做多個標準樣品的對照，對普通實驗室來說難度很大。

1.3環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等[18]在2000年開發的一種新穎恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用Bst DNA polymerase聚合酶在等溫條件(65℃)下保溫1 h，即可完成核酸擴增反應。近年LAMP技術已廣泛應用于包括DNA病毒、RNA病毒、細菌和寄生蟲等傳染性疾病的定性和定量檢測[19-20]。田芳等[21]應用LAMP技術成功檢測出大豆、豆粕及含有大豆成分的飼料樣品中的CP4-EPSPS基因，靈敏度為PCR方法的100～1000倍。LAMP不需要熱循環, 為等溫擴增，擴增效率可達到109～1010數量級,具有操作簡單、特異性強、等溫靈敏、產物易檢測等優點[18]。缺點是引物設計較為復雜，對擴增產物處理不當容易造成DNA污染，影響后續的實驗結果。

1.4基因芯片技術

基因芯片技術是近年來快速發展起來的分子生物學高新技術。在轉基因檢測中，將目前使用的報告基因、啟動子、終止子的特異性片斷制成檢測芯片，與待測產品的DNA進行雜交，掃描信號后經計算機軟件分析，實現對生物樣品快速、高效的檢測。Leimanis等[22]建立了針對轉基因大豆的CaMV35S、NOS標記基因元件的高靈敏度基因芯片檢測技術。基因芯片技術具有高通量、靈敏度高、特異性強等優點，且可平行檢測1個轉基因作物中多個基因或同時檢測多種轉基因作物[23]。其缺點是制作基因芯片技術復雜，成本高昂，需要專門的儀器設備，要求操作人員具有較高的專業素質，這些因素限制了該技術在檢測中的廣泛應用。

2基于蛋白的檢測技術

2.1蛋白免疫印跡雜交技術

蛋白免疫印跡雜交技術(Western Blot)是檢測轉基因作物外源蛋白表達的經典方法，是一種蛋白質轉移電泳技術，其原理是把經聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離的目的蛋白原位固定于固相膜上，再用高濃度的蛋白質溶液孵育固相膜，然后用含有放射性標記或酶標記的特定抗體進行雜交，使抗原—抗體特異性結合，最后通過放射自顯影或者顯色觀察外源基因的表達，根據檢出結果可得知目的蛋白是否表達、濃度大小及分子量大小。Qiu等[24]采用Western blot檢測轉基因水稻中稻瘟菌蛋白激發子的表達，證明該蛋白的過表達增強了水稻抗病性。Western blot技術普遍用于分離、檢測特異的目的蛋白質，具有很高的靈敏性。但是其操作過程繁瑣，費用昂貴，適合應用于研究，不適用于常規實驗和大量樣品的檢測。

2.2酶聯免疫吸附檢測技術

酶聯免疫吸附檢測技術(ELISA)是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶的高效催化反應有機結合起來的一種高靈敏度的檢測技術。其原理是特殊的抗體被結合固定在固體表面，如微孔板上，加入樣品，洗去未被結合的成分。然后加入酶的抗體進行抗原檢測，再次洗去未被結合的成分，樣品中抗原的含量與酶和底物反應的顏色成正比。ELISA有直接法、間接法和雙抗夾心法之分，目前使用最多的是雙抗夾心法，其靈敏度最高。該方法已在大豆、辣椒、煙草、水稻等多種轉化植株的檢測中應用[25-27]。ELISA方法具有簡便、快速、成本低等優點，但其準確性易受復雜基質干擾，檢測范圍受限制。

2.3免疫試紙條檢測技術

免疫試紙條法是將特異的抗體交聯到試紙條和有顏色的物質上，當紙上抗體和特異抗原結合后，再與帶有顏色的特異抗體進行反應，形成三明治狀的色帶，如果沒有抗原，則無顏色反應。已經有商品化的針對大豆、油菜、棉花和甜菜等轉基因作物中的抗除草劑基因CP4-EPSPS的檢測試紙條。丁耀魁等[28]采用快速檢測試紙條測定大豆轉基因含量，測定時間僅需10 min，結果準確，其檢出限可以達到0.1%。試紙條法優點是成本低廉，操作簡單、迅速，不需要特殊的儀器設備，適用于現場檢驗或初篩。但是該方法的缺點是檢測范圍較小，加工后的轉基因產品中的蛋白質抗原性容易被破壞，影響檢測結果的準確性。

2.4蛋白質芯片技術

蛋白質芯片技術是繼基因芯片技術后發展起來的生物檢測技術，是蛋白質組學研究中除了酵母雙雜交、雙向電泳技術、質譜技術等之外的一種重要的工具。蛋白質芯片技術是將已知序列的蛋白、多肽分子、抗原、抗體、酶以預先設計的方式固定在硝酸纖維素膜、玻璃、硅片等載體上排列，待熒光標記的靶分子和探針分子結合后，利用激光掃描系統對熒光信號進行強度檢測分析。該技術目前主要用于藥物學、臨床、細胞周期調控等領域，同時為轉基因植物蛋白的檢測提供了有效手段[29]。蛋白質芯片技術具有快速、平行、自動化等優點，且檢測到的平行數據誤差更小、更準確，這對于高通量研究具有非常重要的意義。

3展望

轉基因技術被稱為“人類歷史上應用最為迅速的重大技術之一”。同時，轉基因技術作為現代農業生物技術的核心，在緩解資源約束、保障食物安全、保護生態環境、拓展農業功能等方面已顯現出巨大潛力。轉基因技術既給人類帶來了巨大的經濟效益，同時也引發了社會關于轉基因植物安全性問題的爭議。轉基因成分檢測技術是轉基因產品安全性管理和標識的技術保障，也是消除公眾對轉基因植物安全質疑的重要環節。近年來，雖然不斷有新的檢測技術出現，但大多數方法處于發展階段，還不能有效地運用到實際工作中。所以，亟待建立快速、有效、準確的轉基因檢測技術體系，使轉基因檢測技術向高通量、高靈敏度、自動化的方向發展。

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(責任編輯：林蕓青)

收稿日期：2015-12-15

作者簡介：王慧遠，女，1997年生。

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.01.026

Research progress on the detecting technique of transgenic plants

WANG Hui-yuan1, JIA Wei-wei1, CHEN Qing-he2

(1.JinglingHighSchool,JiangsuProvince210005; 2.InstituteofPlantProtection,FujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianProvince350003)

Abstract:Detecting technique for transgenic plants and products home and abroad were summarized, emphatically introduced the principal and character of widely applied technologies, including Polymerase chain reaction (PCR) technique, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique, gene chip technique and other detecting technique, and the developing trends and research directions were proposed in this paper.

Key words:Transgene plant; detecting technique; nucleic acid; protein