食品中甲醛殘留量高通量檢測方法研究

潘紅艷，郭啟雷，史海良，楊紅梅（國家食品質量安全監督檢驗中心，北京100094）

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食品中甲醛殘留量高通量檢測方法研究

潘紅艷，郭啟雷，史海良，楊紅梅
（國家食品質量安全監督檢驗中心，北京100094）

摘要：建立食品中甲醛殘留量的高通量快速檢測方法。樣品中的甲醛在酸性條件下與2，4-二硝基苯肼發生加成反應，經高效液相色譜紫外檢測器檢測，流動相乙腈∶水（6∶4，體積比），流速1.0 mL/min，檢測波長355 nm。該方法在0.05 μg/mL～5.0 μg/mL質量濃度范圍內線性關系良好（R2＝0.999 9），檢出限為0.5 mg/kg，加標回收率為80.2 %～107.7 %。該方法操作簡便、快速、實用性廣，可為面粉、粉條、蝦皮、竹筍、腐竹、魚類（魷魚、鯽魚等）、血豆腐等多種食品基質中甲醛殘留量的檢測提供參考。

關鍵詞：甲醛；高效液相色譜；食品

甲醛是一種原生質毒素，可嚴重危害人體細胞、中樞神經系統、皮膚和粘膜，甲醛慢性中毒可導致器官癌變，急性中毒會導致腹瀉、腹痛、嘔吐和頭暈等癥狀[1]。食品中甲醛的來源比較復雜，一是人為添加，不法商販常將甲醛添加到食品中，用于防腐、保鮮、漂白等作用，如食品加工中的“吊白塊”，水產品保鮮中的“福爾馬林”；二是食品本身含有，如某些香菇產品中含有大量甲醛[2]，凍鱈魚等水產品自身代謝產生少量甲醛[3]；三是生產加工過程中受到包裝容器等的污染；四是食品配料中含有的甲醛。

由于食品化學成分較復雜，影響因素較多，因此甲醛殘留量的測定受到食品基體成份的干擾較大[4]。目前甲醛的測定方法有分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[5-8]。李光等[4]用吊白塊在酸性條件下分解出甲醛和二氧化硫等化合物，將蒸餾液用蒸餾水吸收，用顯色劑變色酸或乙酰丙酮與蒸餾液中的甲醛反應，對某些食品同時測定蒸餾液中的二氧化硫和甲醛。此方法耗費時間較長，不利于大量樣品的處理。隋雪燕等[9]采用2，4-二硝基苯肼衍生，環己烷提取，用電子捕獲檢測器氣相色譜法測定，建立了測定紡織品中游離甲醛的衍生氣相色譜法，此方法適用范圍較窄，在實際市場監督中往往涉及多種基質。陳笑梅等[10]研究了直接用于液相色譜測定甲醛與2，4 -二硝基苯肼的反應條件，使反應在弱酸性和50 %的乙腈條件下進行，反應產物甲醛衍生物不需要有機溶劑萃取，可直接用于液相色譜分析，避免了萃取過程的損失。

雖然目前在甲醛殘留量檢測方面的研究較多，現行檢測甲醛的標準有地方標準、國家標準、出入境標準等[11-15]，參考標準種類繁多。文章對現行參考標準中檢測方法進行比較和優化，建立了一個適用性廣，簡便快速的高通量甲醛檢測方法。

1　材料與方法

乙腈、正己烷（色譜純），乙酸鈉，冰乙酸，氯化鈉，磷酸氫二鈉，37 %鹽酸，2，4-二硝基苯肼：純度≥95 %北京市興津化工廠。

Agilent1200高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）：安捷倫公司；恒溫水浴振蕩器：上海申能博彩生物科技有限公司；Milli-Q純水系統：美國Millipore公司；電子天平感量（0.000 1 g、0.01 g）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HY-5回旋振蕩器：國華電器有限公司；微孔濾膜0.22 μm，有機相津騰。

1.1試劑配制

衍生液1：稱取25 mg 2，4-二硝基苯肼溶于6 mL 37 %鹽酸，加水定容至25 mL。

衍生液2：（乙酸鈉緩沖溶液，pH＝5）為稱取3.64 g乙酸鈉，以適量水溶解，加入1.0 mL冰乙酸，用水定容至500 mL。2，4-二硝基苯肼溶液（0.6 g/L）為稱取2，4-二硝基苯肼300 mg，用乙腈溶解定容至500 mL。量取100 mL乙酸鈉緩沖溶液和100 mL 2，4-二硝基苯肼溶液混勻，配制成衍生液2。

衍生液3：稱取50 mg 2，4-二硝基苯肼，乙腈定容至25 mL。

鹽酸-氯化鈉溶液：稱取2g氯化鈉于100mL容量瓶中，用少量水溶解，加6mL37%鹽酸，加水定容至刻度。

磷酸氫二鈉溶液：稱取18 g Na2HPO4·12 H2O，加水定容至100 mL。

甲醛標準儲備液：取1 mL 36 %～38 %甲醛溶液，用水定容至500 mL，使用前按GB/T 2912.1-1998中的亞硫酸鈉法標定甲醛濃度。此溶液于棕色瓶中4℃冰箱中保存，一個月內穩定。準確量取一定量經標定的甲醛標準儲備液，配制成50 μg/mL的甲醛標準應用液，此溶液現用現配。

1.2樣品處理

試樣選取可食用部分經粉碎機充分粉碎并混合均勻，面粉、粉絲、腐竹等試樣在0℃～4℃冷藏，蝦皮、竹筍、魚類、血豆腐等在-18℃以下保存。

稱取均勻粉碎的試樣2.0 g（準確至0.01 g），置于50 mL三角瓶中，準確加入20.0 mL衍生液2。蓋上塞子，渦旋混勻后置于60℃恒溫振蕩器中150 r/min振搖1 h，取出冷卻至室溫。取上層清液過0.22 μm濾膜上機測定。

若試樣中脂肪含量較高，取上述提取液10 mL于50 mL塑料離心管中，加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液，渦旋混合，離心后棄去上清液，取下層溶液過0.22μm濾膜上機測定。

1.3甲醛衍生物標準溶液的制備

移取0、10、20、100、200、400 μL甲醛應用液（50 μg/mL），置于10 mL具塞刻度管中，用衍生液2定容至10 mL，蓋上塞子后搖勻，60℃水浴加熱1 h，取出冷卻至室溫。過0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測定。

1.4儀器條件

色譜柱：Agilent C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：乙腈∶水為（60∶40，體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：355 nm；進樣量：20 μL

2　結果與討論

2.1方法對比

2.1.1衍生液比較

比較3種檢驗標準中不同衍生條件對測定結果的影響。涉及的檢驗標準為：SC/T 3025-2006《水產品中甲醛的測定》；SN/T 1547-2011《進出口食品中甲醛的測定液相色譜法》；GB/T 21126-2007《小麥粉與大米粉及其制品中甲醛次硫酸氫鈉含量的測定》。

取一定量甲醛應用液于10 mL具塞刻度管中，分別按3種檢驗標準的衍生方法在同一溫度下衍生相同時間。

2.1.1.1 SC/T 3025-2006《水產品中甲醛的測定》

取0.5 mL甲醛應用液于10 mL具塞刻度管中，加入0.2 mL衍生液1，加水定容至10 mL，渦旋混勻后60℃水浴30 min。取出冷卻至室溫，過0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測定。

2.1.1.2 SN/T 1547-2011《進出口食品中甲醛的測定液相色譜法》

取0.5 mL甲醛應用液于10 mL具塞刻度管中，加衍生液2定容至10 mL，渦旋混勻后60℃水浴30 min。取出冷卻至室溫，過0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測定。2.1.1.3 GB/T 21126-2007《小麥粉與大米粉及其制品中甲醛次硫酸氫鈉含量的測定》

取0.5 mL甲醛應用液于10 mL具塞刻度管中，加入2 mL鹽酸氯化鈉，1 mL磷酸氫二鈉，0.5 mL衍生液3，加水定容至10mL。渦旋混勻后60℃水浴30 min。取出冷卻至室溫，過0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測定。

比較不同衍生液在同一衍生條件下產生的甲醛衍生物的峰面積，比較結果見圖1。

圖1不同衍生液比較Fig.1 Different derived liquid comparison

圖2衍生溫度比較Fig.2 Derived temperature comparison

由圖1可見，2號衍生液和3號衍生液的衍生效果相當，其中以2號效果最佳，乙腈和2，4-二硝基苯肼的含量均對衍生效果產生一定影響，陳笑梅[10]等的研究也說明乙腈含量在20 %～70 %之間對衍生反應有較好的作用。當樣品中含有較高的甲醛時，也需要有充分的2，4-二硝基苯肼與其發生反應，因此選取SN/T 1547-2011《進出口食品中甲醛的測定液相色譜法》中的衍生液進行進一步衍生條件的優化。

2.1.2衍生溫度選擇

取甲醛應用液0.5 mL于10 mL具塞刻度管中，加衍生液2定容至10 mL，渦旋混勻后分別置于恒溫水浴鍋中衍生30 min，取出冷卻至室溫，過0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測定。根據3個不同標準給出的不同衍生溫度，選取40、50、60、70℃4個溫度進行比較，分析其對甲醛衍生物的峰面積的影響，比較結果見圖2。

由圖2可見，在溫度為60℃時，甲醛衍生物的峰面積最高，溫度有助于衍生反應的進行，而溫度過高可能會導致衍生物的不穩定。因此實驗選取60℃為最佳衍生溫度。

2.1.3衍生時間選擇

取甲醛應用液0.5 mL于10 mL具塞刻度管中，加衍生液2定容至10 mL，渦旋混勻后60℃水浴，過0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測定。同時選取四種基質（腐竹、血豆腐、蝦皮、面粉）加入適量甲醛應用液，分析基質干擾對衍生時間的影響。根據3種不同標準給出的衍生時間，分別測定衍生10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min后所生成衍生物的峰面積。比較結果見圖3。

圖3衍生時間比較Fig.3 Derived time comparison

由圖3可見，甲醛應用液在水浴30 min時刻達到最高峰面積，隨著衍生時間的繼續增加，峰面積有所降低并趨于穩定。腐竹、血豆腐、蝦皮、面粉的最佳衍生時間分別是60、60、70、70 min，蝦皮在60 min之后的衍生效果并沒有顯著性變化，由此看出不同樣品基質的存在會對衍生過程起到一定程度的影響，綜合各種不同基質，試驗最終選取60℃水浴60 min為合理衍生時間。

2.1.4色譜條件優化

經二極管陣列檢測器的波長掃描，甲醛衍生物2，4-二硝基苯腙的吸收圖譜見圖4，根據此圖譜試驗最終選取檢測波長為355 nm。

圖4甲醛衍生物吸收圖譜Fig.4 Absorption spectrum of formaldehyde derivatives

對比了乙腈與水的體積比比例在70∶30、60∶40、 50∶50分別在0.8 mL/min和1.0 mL/min的流速下甲醛衍生物的色譜峰，實驗結果表明乙腈與水的體積比在60∶40，流速為1.0 mL/min時，色譜峰的保留時間和分離效果最好，并不受基質中的雜峰干擾，色譜如圖5所示。

圖5甲醛標準溶液衍生物色譜圖Fig.5 Chromatogram of formaldehyde derivative

2.2線性關系和檢出限

在本方法最終確定的條件下對甲醛標準溶液進行測定，甲醛濃度在0.05 μg/mL～5.0 μg/mL范圍內具有良好的線性關系，線性方程為y＝745.27x - 1.262，相關系數R2＝0.999 9。樣品檢出限為0.5 mg/kg。

由于空氣、試劑等中均有微量甲醛殘留，因此在試驗中需進行空白試驗，除不加試樣外，其他過程均按1.3步驟進行處理。結果計算時需扣除空白。

2.3方法回收率和精密度

對面粉、粉條、蝦皮、竹筍、腐竹、鯽魚、血豆腐樣品進行基質加標試驗，按試驗最終選定的方法步驟進行，平行測定5次，結果見表1。

表1方法回收率和精密度（n=5）Table 1 The recovery and precision of the method

由表1可知，分別在樣品中加入0.5、1.0、5.0 mg/kg的甲醛標準溶液，得到的回收率在80.21 %～107.66 %之間，方法回收率較好，可實現對食品中甲醛殘留量的快速檢測。

3　結論

建立了食品中甲醛殘留量的快速測定方法，實現在同一時間對多個樣品的批量處理。在酸性條件下，樣品中殘留的甲醛與2，4-二硝基苯肼發生加成反應，生成黃色的2，4-二硝基苯腙，提取液在355 nm波長下，經液相色譜法（HPLC）測定，外標法定量。此方法適用于面粉、粉條、蝦皮、竹筍、腐竹、魚類（魷魚、鯽魚等）、血豆腐等多種食品基質中甲醛殘留量的鑒別及檢測。方法快速簡便，靈敏度高，重現性好。可滿足對多種食品中甲醛含量的準確測定。

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The Study of High-throughput Detection Method for Formaldehyde Residues in Food

PAN Hong-yan，GUO Qi-lei，SHI Hai-liang，YANG Hong-mei
（National Food Quality & Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

Abstract：A rapid detection method was developed. The samples were addition with 2，4 -dinitrophenylhydrazine under acidic conditions，detected by HPLC UV detector. The mobile phase was acetonitrile∶water（6∶4，mL/mL），at a pump flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength of 355 nm. Under the optimal conditions，the linear range of formaldehyde was 0.05 μg/kg-5.0 μg/kg with correlation coefficient higher than 0.999 9，the limit of quantification was 0.5 mg/kg，the mean recoveries were 80.2 %-107.7 %. This method was simple，rapid and suitable for most food matrices such as flour，vermicelli，shrimp，bamboo shoots，yuba，fish（Carp，Squid etc），blood tofu etc.

Key words：formaldehyde；HPLC；food

收稿日期：2014-09-09

作者簡介：潘紅艷（1986—），女（漢），助理工程師，碩士研究生，研究方向：食品安全。

基金項目：公益性行業科研專項項目（2012104003-2）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.037