乳腺生物反應(yīng)器在生物制藥領(lǐng)域研究進(jìn)展

毛婕

(鹽城師范學(xué)院，江蘇 鹽城 224000)

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乳腺生物反應(yīng)器在生物制藥領(lǐng)域研究進(jìn)展

毛婕

(鹽城師范學(xué)院，江蘇 鹽城 224000)

摘要：文章綜述了乳腺生物反應(yīng)器的原理、應(yīng)用、優(yōu)點(diǎn)、問(wèn)題,并對(duì)其發(fā)展方向進(jìn)行了展望。利用乳腺生物反應(yīng)器獲得的藥用蛋白在生物制藥工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，目前使用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)由于其固有的局限性，未能使乳腺生物反應(yīng)器的研究取得了很大的進(jìn)步。基因打靶和核移植技術(shù)已成為乳腺生物反應(yīng)器的發(fā)展注入了新的活力。本文總結(jié)了乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)與問(wèn)題，同時(shí)說(shuō)明乳腺生物反應(yīng)器在生物制藥研究領(lǐng)域的必要性。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因技術(shù)；動(dòng)物乳腺反應(yīng)器；生物制藥

引言

外源基因?qū)雱?dòng)物基因組和在動(dòng)物乳腺中表達(dá)，動(dòng)物乳腺能夠高效利用合成蛋白質(zhì)及乳汁的分泌，在一些通用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥用蛋白具有重要價(jià)值。利用乳腺生物反應(yīng)器降低生物醫(yī)藥成本，便于大規(guī)模生產(chǎn)，具有極大的商業(yè)價(jià)值。目前世界上有很多成功例子，可以通過(guò)外源基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)高效表達(dá)乳汁。然而乳腺生物反應(yīng)器在應(yīng)用還上存在著很大的技術(shù)瓶頸。

1乳腺生物反應(yīng)器的原理

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的原理是重組DNA技術(shù)的應(yīng)用和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在乳腺特異性調(diào)控序列的外源基因下，然后轉(zhuǎn)移基因到原核期或1～22動(dòng)物胚胎細(xì)胞的受精卵，通過(guò)回收乳汁。通過(guò)胚胎移植后轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺表達(dá)的個(gè)體，獲得的表達(dá)產(chǎn)物。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥用蛋白的基本過(guò)程如圖1。

圖1用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥用蛋白的基本過(guò)程

提高外源基因表達(dá)量是乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)載體的關(guān)鍵步驟。在乳腺組織中特異表達(dá)外源基因，需要一個(gè)啟動(dòng)子和調(diào)控乳蛋白基因的區(qū)域，即啟動(dòng)序列的乳蛋白基因的表達(dá)在哺乳期。目前，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器主要是β-乳球蛋白基因的調(diào)控序列調(diào)控元件(BLG)，β-酪蛋白基因的調(diào)控序列，乳清酸蛋白(WAP)基因的調(diào)控序列和乳清白蛋白基因調(diào)控序列，乳腺組織特異表達(dá)的調(diào)控元件可以跨越物種界限。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是乳腺生物反應(yīng)器制備的核心技術(shù)。目前，除了原核顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的方法，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方法，和精子介導(dǎo)法，胚胎干細(xì)胞(ES)介導(dǎo)，基因打靶，體細(xì)胞克隆。所有的轉(zhuǎn)基因方法有其獨(dú)特的每種方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性，但是轉(zhuǎn)基因顯微注射法仍然是主要的方法。

2乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用

通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的主要的生物藥品：

2.1人乳鐵蛋白

乳鐵蛋白最早由科學(xué)家在母乳中的牛奶發(fā)現(xiàn)。隨后，在一些生物體的體液和各種細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)這種蛋白。科學(xué)家們做了大量的研究，研究表明，乳鐵蛋白是一種多功能蛋白。法國(guó)的研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)乳鐵蛋白能對(duì)細(xì)胞分裂活性和解毒酶活性的調(diào)節(jié)，并能增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的活性。此外，乳鐵蛋白能明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。近年來(lái)，隨著生物制藥技術(shù)的發(fā)展和成熟，許多科學(xué)家開(kāi)始注意到乳鐵蛋白的實(shí)用價(jià)值。科學(xué)家們利用分子生物學(xué)原理，已經(jīng)完成了在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)乳鐵蛋白功能的進(jìn)行研究，并臨床試驗(yàn)，確定了七個(gè)功能，對(duì)人體有：廣譜抗菌效果，抗病毒作用，抗氧化，抗癌，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)胃腸道鐵的吸收，和其他協(xié)同效應(yīng)藥物。

2.2人組織型溶纖酶原激活因子

溶栓因子是一種蛋白質(zhì)分子組成，這些分子可以使血塊溶解引起的心肌梗塞和腦血栓形成。HTPA是成員之一，它自然存在于人體，可以轉(zhuǎn)換或激活溶血酶原為溶血酶，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度對(duì)骨架成分血纖維血栓形成。通常是在血管壁的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。通過(guò)靜脈注射藥物，該藥物能加速溶栓，疏通血液循環(huán)。與其他溶栓藥物相比，人組織型纖溶酶原激活劑溶液有高效力，血栓形成的特異性高，副作用小，低死亡率等特點(diǎn)。人組織型纖溶酶原激活劑溶液是第三代溶栓藥物，第一，二代溶栓藥物有尿激酶和鏈激酶。

2.3人血白蛋白

人血白蛋白在維持體液平衡的同時(shí)也是最重要的血液蛋白之一，它還參與調(diào)節(jié)脂肪酸的運(yùn)輸和激素調(diào)節(jié)。當(dāng)靜脈注射給藥，通過(guò)滲透作用的過(guò)程，人血白蛋白可以增加血容量。廣泛應(yīng)用于臨床休克，肝壞死，燒傷，蛋白質(zhì)缺乏癥，成人呼吸綜合征，冠狀動(dòng)脈移植術(shù)等。全球每年需求量為500噸，是目前的主要來(lái)源是通過(guò)人的血液中提取。由于廣泛流行的艾滋病，肝炎，應(yīng)用更多的同時(shí)人類血液提取人血白蛋白更多的限制。基因工程生產(chǎn)人血白蛋白的使用將成為未來(lái)血清蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。由于其廣泛的應(yīng)用，需求高，傳統(tǒng)工藝發(fā)酵不能滿足臨床的需要。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥由于產(chǎn)量高，成本低的特點(diǎn)，是生產(chǎn)人血白蛋白的最好方式。

3乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺是由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺的正常分泌，產(chǎn)生目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器與基因工程細(xì)胞反應(yīng)器相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)

3.1生物藥品高活性、人源化

由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物屬于高等真核生物，徹底解決的問(wèn)題是翻譯后能夠修飾，并且確保了生物藥物的生物活性。這些基因都是從人體獲得，徹底解決免疫排斥的問(wèn)題，治療效果非常顯著。

3.2高產(chǎn)量、高質(zhì)量

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器中應(yīng)用最為廣泛的，效果是最好的。乳汁分泌，乳汁中的天然蛋白質(zhì)總含量約占3%，主要乳蛋白占總蛋白的12%。如果基因藥物的生產(chǎn)也在這一范圍內(nèi)，然后在30%到50%的純母乳中的生物藥物。如此高的產(chǎn)量和純度，不僅可以大大降低制造成本，而且可以簡(jiǎn)化純化工作程序。此外，由于操作步驟的純化過(guò)程中減少，生物制藥的產(chǎn)品活性可以保持完整，質(zhì)量也能夠改進(jìn)。

3.3高效益、低成本

通過(guò)計(jì)算動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)1g藥物蛋白的使用量，目前的價(jià)格約為800美元至5000美元，然而轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的使用只有0.5美元。奶牛每年可生產(chǎn)純蛋白40kg，奶山羊每年2.5～5kg，兔子每年只能生產(chǎn)純蛋白0.1kg。據(jù)估計(jì)，僅利用常規(guī)生物制藥成本太高，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器藥品生產(chǎn)，單位成本很低。動(dòng)物乳腺表達(dá)外源基因可以遺傳給后代，所以一旦可以產(chǎn)生一些有價(jià)值的動(dòng)物蛋白的個(gè)體，可以通過(guò)人工授精，胚胎分裂和其他手段克隆擴(kuò)大商業(yè)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的后代數(shù)量，大規(guī)模生產(chǎn)，并可以繼續(xù)從優(yōu)良品種動(dòng)物后代中獲取巨額利潤(rùn)。

3.4低耗能、少污染

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)藥品的使用，能夠在人為控制條件下清潔畜牧業(yè)，不會(huì)消耗大量的能源，沒(méi)有從工業(yè)排放的有害化學(xué)物質(zhì)。動(dòng)物乳腺是一個(gè)完美的“分子農(nóng)業(yè)”可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化和重組蛋白，包括糖基化處理，磷酸化，羧基和分子組裝等。利用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物，生物活性好，非常接近自然的產(chǎn)品。在藥物蛋白生產(chǎn)過(guò)程中不產(chǎn)生工業(yè)廢水，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，乳腺生物反應(yīng)器的產(chǎn)品屬于純生物產(chǎn)品，質(zhì)量安全，無(wú)污染。

4乳腺生物反應(yīng)器存在的問(wèn)題

雖然轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器技術(shù)已經(jīng)取得了一些成就，展示了廣闊的發(fā)展?jié)摿颓熬埃蓮V泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中存在許多理論和技術(shù)問(wèn)題需要解決。

4.1外源基因在動(dòng)物體內(nèi)的整合位點(diǎn)問(wèn)題

因?yàn)槿藗冞€沒(méi)有完全掌握乳蛋白基因表達(dá)的調(diào)控，目的基因和整合機(jī)制的整合，所以對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的整合位點(diǎn)不適合基因轉(zhuǎn)移的選擇，經(jīng)常出現(xiàn)不穩(wěn)定的遺傳性狀，甚至缺乏等問(wèn)題。

4.2轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化問(wèn)題

表達(dá)產(chǎn)物往往是理論的內(nèi)容和含量高，但比發(fā)酵工程的目的蛋白純化簡(jiǎn)單，刪除所有可能引起病變的細(xì)菌，病毒和人類過(guò)敏性蛋白和乳汁中的其他微生物，這些問(wèn)題將對(duì)蛋白的純化帶來(lái)一定的困難。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率低，制造成本低，目的蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于牛奶，總蛋白含量的基因分離，轉(zhuǎn)化，載體構(gòu)建，體細(xì)胞克隆技術(shù)還不成熟。

4.3目的蛋白的翻譯后修飾問(wèn)題

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以將外源蛋白修改，和動(dòng)物身上所有的外源物質(zhì)產(chǎn)生排斥作用的保護(hù)系統(tǒng)，蛋白水解過(guò)程，λ羧化不充分，糖基化形式與人類不同等。產(chǎn)品安全問(wèn)題，外源基因在動(dòng)物和基因藥物的入侵對(duì)正常的身體功能的任何影響，會(huì)造成基因污染，很難確定。為了解決在動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的理論突破性的技術(shù)路線，在進(jìn)一步的研究中存在的問(wèn)題和逐步提高。

4.4外源基因在動(dòng)物乳腺中特異表達(dá)問(wèn)題

一些基因發(fā)生異位表達(dá)導(dǎo)入外源基因，導(dǎo)致動(dòng)物泌乳停止。乳蛋白基因的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，與宿主染色體整合目的基因的機(jī)制，在不同的生產(chǎn)性能差異的原因或基因表達(dá)調(diào)控元件，用于蛋白質(zhì)的加工修飾乳腺細(xì)胞機(jī)制尚不清楚。

5展望

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器，創(chuàng)造了一個(gè)新的現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，已成為最活躍的研究領(lǐng)域之一，最具有商業(yè)前景的生物反應(yīng)器技術(shù)。動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器，但仍有許多問(wèn)題需要進(jìn)一步研究和探索，但它仍然是一種理想的藥用蛋白的生產(chǎn)工具，在現(xiàn)代生物制藥技術(shù)有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)，將成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥領(lǐng)域改革的方向，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

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中圖分類號(hào):Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1671-1602(2016)06-0029-02

作者簡(jiǎn)介：毛婕(1993.10-)，女，漢，江蘇鹽城人，就讀于鹽城市師范學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院,預(yù)備黨員、學(xué)生會(huì)副主席，多次獲得一等獎(jiǎng)學(xué)金、國(guó)家獎(jiǎng)學(xué)金、校級(jí)三好學(xué)生、學(xué)風(fēng)建設(shè)月活動(dòng)先進(jìn)個(gè)人等榮譽(yù)，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。