前處理對(duì)速溶咖啡中多菌靈高效液相色譜檢測(cè)的影響

劉丹丹 何飛飛 王志洪 郝淑美

摘 要：采用3種不同的萃取方法提取純化速溶咖啡中的多菌靈，再利用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)凈化方式的繁簡(jiǎn)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差值，確定多菌靈適宜的提取方法。結(jié)果表明，超聲提取的結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差最小，可以考慮作為速溶咖啡中多菌靈殘留量檢測(cè)的參考方法。

關(guān)鍵詞：速溶咖啡；多菌靈；超聲提取；高效液相色譜

中圖分類號(hào) S571.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）06-135-02

Influence of Pretreatment Methods for the Determination of Carbendazim Content in Instant Coffee by HPLC

Liu Dandan1 et al.

（1Agricultural College，Yunnan University，Kunming 650091，China）

Abstract：Three different extraction and purification methods were performed to detect carbendazim residues in instant coffee using high performance liquid chromatography. The optimum method was selected according to the methods of extraction and purification and the percentage of relative standard deviation. The results indicated that ultrasonic pretreatment showed higher accuracy and lower relative error，compared with the other two pretreatment methods，and thus could be used as the reference method for the determination of carbendazim residues in instant by HPLC.

Key words：Instant coffee；Carbendazim；Ultrasonic pretreatment；HPLC

咖啡作為一種深受人們喜愛(ài)的飲品，對(duì)其需求量日益劇增。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)咖啡消費(fèi)者的數(shù)量越來(lái)越大，其安全問(wèn)題也逐漸成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。咖啡中的農(nóng)業(yè)殘留主要是由于種植過(guò)程中使用或環(huán)境中攝入的，常用的殺蟲(chóng)及殺菌劑有六六六、滴滴涕、樂(lè)果、百菌清、多菌靈、甲基托布津等[1]。隨著農(nóng)藥的使用越來(lái)越多，環(huán)境中的農(nóng)藥殘留也日益嚴(yán)重，已成為影響食品安全的瓶頸。這些農(nóng)藥的種類繁多，性質(zhì)各異，在食品中的殘留量極低，傳統(tǒng)的分析方法難以保證其檢測(cè)精度。目前，測(cè)定農(nóng)藥殘留主要采用離子-氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法[2]，但其測(cè)定費(fèi)用較高且針對(duì)性較差。隨著現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，開(kāi)發(fā)高效準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，以及嚴(yán)格的農(nóng)藥限量標(biāo)準(zhǔn)尤其重要。目前，對(duì)于咖啡的農(nóng)藥殘留檢測(cè)均局限于對(duì)咖啡豆的檢測(cè)[3]，還沒(méi)有關(guān)于速溶咖啡檢測(cè)的報(bào)道。農(nóng)業(yè)部NY/T289—1995在標(biāo)準(zhǔn)中只是規(guī)定了六六六、滴滴涕2種農(nóng)藥的殘留量及測(cè)定方法[4]。

多菌靈為內(nèi)吸性光譜殺菌劑，對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)酸、堿不穩(wěn)定，該農(nóng)藥一旦被植物吸收到體內(nèi)即產(chǎn)生藥效，是一種常見(jiàn)的殺菌劑。目前對(duì)于多菌靈農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法在黃瓜及茶葉中在咖啡豆中均有報(bào)道[1，4]，檢測(cè)方法多為氣相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等[2，5-7]。其中，質(zhì)譜連用方法靈敏度高，但是價(jià)格昂貴，運(yùn)行成本較高。因此，建立一種快速、高效、易推廣的檢測(cè)方法具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。為此，本文通過(guò)加標(biāo)回收使用3種不同的方法對(duì)速溶咖啡中的多菌靈進(jìn)行提純凈化，通過(guò)比較探討多菌靈最適宜的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 儀器：高效液相色譜儀（Waters，e2695），配2489型紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，超聲波振蕩儀器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。標(biāo)準(zhǔn)品：多菌靈99.5%（購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）。試劑：甲醇、乙酸、鹽酸、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、檸檬酸氫二鈉、乙腈、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑，以上均購(gòu)自阿拉丁試劑公司，色譜純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 準(zhǔn)確稱取適量的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，先用少量的鹽酸溶液微熱溶解，再用該鹽酸溶液定容，配成濃度為1.00mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.2.2 色譜條件 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：282nm；色譜柱：Waters SunFire C18（5μm，4.6×150mm）；流動(dòng)相：A：甲醇（含2%乙酸）；B：水；0min，20%A80%B；1min，25%A75%B；12min，45%A55%B；13min，90%A 10%B；15min，20%A80%B；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10μL。

1.2.3 樣品前處理 本試驗(yàn)采用濃度為4.0mg/L多菌靈的農(nóng)藥處理速溶咖啡樣品，采用3種不同的方法提取凈化多菌靈進(jìn)行液相色譜法測(cè)定，以便篩選最佳前處理方法。

1.2.3.1 處理1 （1）稱取1g咖啡粉，用37μm（相當(dāng)于400目）篩選，加入25.0mL乙腈，高速混勻2min。（2）加入15g無(wú)水硫酸鎂，劇烈振搖1min，2 500r/min離心5min，靜置30min分層。（3）取1.0mL乙腈于2mL離心管中，加入200mg無(wú)水硫酸鎂和50mg PSA（N-丙基乙二胺），2 500r/min離心5min。（4）準(zhǔn)確吸取0.5mL乙腈溶液，加入0.5mL離子對(duì)試劑，振蕩后過(guò)0.45μm濾膜，待測(cè)。

1.2.3.2 處理2 （1）取稱取1g樣品，用37μm（相當(dāng)于400目）篩選，放入250mL具塞三角瓶中。（2）加入100mL丙酮/水（50/50，v/v）提取液。浸泡0.5h后振蕩提取1h。抽濾，量取濾液轉(zhuǎn)入250mL分液漏斗中。（3）加入20mL飽和氯化鈉溶液、50mL二氯甲烷。振蕩萃取1min，靜置分層，下層有機(jī)相過(guò)無(wú)水硫酸鈉，水相再用二氯甲烷50mL萃取2次，合并3次萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（水浴溫度40℃）濃縮，甲醇定容至1mL，待測(cè)。

1.2.3.3 處理3 （1）稱取1g咖啡粉，用37μm（相當(dāng)于400目）篩選，置于100mL具塞三角瓶中。（2）加入40mL甲醇，超聲波（280W）振蕩10min；然后在振蕩器100r/min振蕩30min提取。（3）加入1mol鹽酸4mL，10g/L氯化鈉40mL，混勻后加入40mL二氯甲烷。（4）水相用2mol氨水中和至pH值為7.5～8，返回分液漏斗中，加入40mL二氯甲烷，劇烈振蕩，靜置分層。（5）有機(jī)相過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱至平底燒瓶中，水相中再加入二氯甲烷40mL，重復(fù)操作，二氯甲烷分2次從水溶液中提取多菌靈，合并有機(jī)相，40℃進(jìn)行減壓蒸餾。（6）殘?jiān)扔?mL甲醇溶解，移入10mL容量瓶中，清洗2次，定容，過(guò)0.45μm微孔濾膜后于液相色譜測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

從圖1可以看出，多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為14.488min，峰圖對(duì)稱性好，沒(méi)有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。以樣品濃度x（mg/L）對(duì)峰面積y求出回歸方程并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。多菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=33427x+410.7；相關(guān)系數(shù)r2=0.999。

用標(biāo)準(zhǔn)品處理的咖啡樣品中多菌靈的含量，結(jié)果如表1。由表1可知，處理3（超聲提取凈化法）純化得到的多菌靈的含量為4.58mg/L，與加入標(biāo)準(zhǔn)品的濃度最接近，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和相對(duì)誤差均較小，說(shuō)明該方法測(cè)定得到的結(jié)果最準(zhǔn)確；處理1和處理2提取純化多菌靈的方法雖簡(jiǎn)單，但測(cè)定的含量偏低，結(jié)果不穩(wěn)定，并且回收率均偏低，這2種方法還需改進(jìn)。處理3由于經(jīng)過(guò)多次純化，測(cè)定方法準(zhǔn)確，精密度較高，可以作為測(cè)定多菌靈的推薦方法。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn).黃瓜中百菌清殘留量的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.（GB/T 5009.105-2003）.

[2]王登飛，陳練洪，游俊，等.固相萃取-HPLC法同時(shí)測(cè)定果蔬中多菌靈和噻菌靈殘留量[J].農(nóng)藥，2008，47（6）：443-447.

[3]劉春華，樂(lè)淵，陽(yáng)辛風(fēng)，等.超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，24：108-110.

[4]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.小粒種咖啡病蟲(chóng)害防治技術(shù)規(guī)程（NY/T1698-2009）[S].

[5]薛思佳，賀紅武，王濤，等.新穎除草劑研究進(jìn)展[J].化學(xué)世界，2002，11（11）：608-614.

[6]饒欽雄，曲明清，趙曉燕，等.HPLC法測(cè)定常見(jiàn)蔬菜水果中多菌靈、噻菌靈和苯菌靈殘留量[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（4）：85-88.

[7]王學(xué)貴，張琴，徐漢虹，等.高效液相色譜測(cè)定茶葉中多菌靈的殘留[J].農(nóng)藥，2009，48（1）：55-57.

（責(zé)編：張宏民）