禽類多瘤病毒APV-1晚期基因多順反子的EGFP標記載體構建和表達

李　勁，劉　琳

(中南民族大學 生命科學學院，武漢 430074)

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禽類多瘤病毒APV-1晚期基因多順反子的EGFP標記載體構建和表達

李勁，劉琳

(中南民族大學 生命科學學院，武漢 430074)

摘要為研究禽類多瘤病毒晚期基因多順反子翻譯起始調控的機制，設計和構建了以增強綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因替代病毒APV-1野生型的晚期結構蛋白VPs基因的真核雙順反子表達載體，并觀察其在轉染進入禽類原代成纖維細胞中的表達翻譯狀態.以APV-1 的cDNA克隆(pHL1003)為模板， 運用PCR技術擴增出與野生型病毒APV-1相同的Ori區、早期編碼區和晚期Agno-1a區序列作為載體片段；從質粒pEGFP-N1中擴增出編碼綠色熒光的EGFP DNA片段；經連接構成重組質粒pHL1003-GFP，通過脂質體細胞轉染方法將質粒DNA轉染到雞胚胎和鵪鶉胚胎成纖維細胞中，通過細胞培養觀察熒光表達狀況. DNA序列分析證實了重組克隆中的EGFP序列與已知的質粒pEGFP-N1中EGFP序列一致.轉染72 h后觀察雞和鵪鶉胚胎成纖維細胞，轉染成功胚胎細胞明顯表達較強的熒光，說明 GFP可以在構建的雙順反子重組質粒的下游中正常表達并產生熒光.pHL1003-GFP 重組質粒的構建及其在禽類原代成纖維細胞中的高效表達，為我們研究多順反子翻譯起始調控中Agno-1a基因的表達對下游病毒結構蛋白基因的翻譯調控機制提供了簡潔易用的系統和模型.

關鍵詞禽類多瘤病毒；增強綠色熒光蛋白；重組質粒；轉染；表達

Construction and Expression of the Polycistronic Vector of Avian Polyomavirus 1 Late Genes Tagged withEGFP

LiJin，LiuLin

(College of Life Science，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074, China)

AbstractTo study the mechanism of translational initiation regulation of the polycistronic mRNA of the Avain Polyomavirus late genes, the eukaryotic expression vector with bi-cistronic mRNA was designed and constructed, in which the downstream late structural proteins of wild-typeAPV-1 were replaced by EGFP reporter gene. By transfection of the recombinant DNA into the bird primary fibroblast cells, the expression of EGFP was observed. UsingAPV-1 cDNA plasmid as template, the early and Ori regions includingAgno-1agene of the viral genome were amplified by PCR. TheEGFPcoding sequence was amplified from plasmid pEGFP-N1. After ligation of the above two kinds of DNA fragments, the recombinant plasmid pHL1003-GFP was identified by restriction enzyme digestions, PCR and DNA sequencing. The viral recombinant DNA was transfected into chicken embryo and quail embryo fibroblasts by lipofection respectively. TheEGFPDNA sequence of the recombinant pHL1003-GFP was consistent with theEGFPsequence in the pEGFP-N1 plasmid by DNA sequencing analysis. After 72 h transfection , theGFPgene at downstream of the bi-cistronic mRNA was able to be expressed effectively, and the strong fluorescence of the GFP was excited in chicken embryo and quail embryo fibroblast cells. The construction of pHL1003-GFP recombinant plasmid and its highly expressed GFP with strong capability of fluorescence excitation in avian primary fibroblast cells provide a simple and easy testing system and an experimental model to explore the translational regulation mechanism in poly-cistronic mRNA of theAgno-1agene for its downstream genes expression, which codingAPV-1 late structural proteins.

Keywordsavian polyomavirus; EGFP; recombinant plasmid; transfection; expression

禽類多瘤病毒(APV-1)，也稱鸚鵡幼雛病病毒(BFDV)，能引起多種鸚鵡幼雛死亡的急性病毒性傳染病[1-2].APV-1基因組分為早期基因編碼區、晚期基因編碼區及非編碼調控區(Ori)[3]，Ori區位于早期編碼區和晚期編碼區之間，分別調控早晚期基因表達(見圖1).Ori區包含DNA復制起始位點，早期基因啟動子(PE)、晚期基因啟動子(PL1和PL2)和增強子序列.早期基因編碼區包含大T抗原、小t抗原的開放閱讀框(ORF)，這兩種蛋白在病毒DNA開始復制前合成.晚期基因啟動子PL1調控晚期基因轉錄并通過選擇性拼接(intron-1/-2a/-3)可產生兩種多順反子mRNAs Agno-1a + VP1(大量)和Agno-1a + VP2/3 + VP1 (少量)，分別編碼Agno-1a(大量)、VP2、VP3和VP1蛋白(大量)[4].對APV-1的晚期基因編碼的前導蛋白Agno-1(1a和1b)和Agno-2(2a和2b)的結構和功能的研究發現，依其mRNA不同的選擇性剪切(intron-1a/1b和intron-2a/2b)，APV-1的晚期基因PL1、PL2兩個啟動子可驅動轉錄并隨后加工形成6種成熟的多順反子mRNAs，分別合成4種前導蛋白(和VP1/2/3)大量的Agno-1a蛋白、少量的Agno-1b、蛋白Agno-2a蛋白和Agno-2b蛋白[5].Agno-1a是一種外殼蛋白VP4并與Agno-1b一起導致雞胚成纖維細胞的凋亡[6 ].在研究APV-1感染CEF細胞的病毒蛋白質表達的動力學實驗中，APV-1感染早期(24 hpi前)以Agno-1a合成占優，其后改變為以VP-1合成為主，形成一種基因表達從Agno-1a到VP-1的switch現象，引發針對Agno-1a在多順反子翻譯調控中作用的研究.

本文構建以增強型綠色熒光蛋白GFP氨基酸編碼序列替代APV-1晚期結構蛋白下游VPs氨基酸編碼序列(VP2/3和VP1)為報告基因的APV-1 cDNA多順反子表達質粒，位于多順反子下游的EGFP報告基因可以在禽類成纖維細胞中高效表達熒光蛋白，從而為研究多順反子翻譯起始調控中上游的Agno-1a基因對下游病毒結構蛋白基因的調控作用提供了簡潔易用的系統和模型.

圖1　禽類多瘤病毒全基因組線性圖Fig.1　The linear map of Avian Polyomavirus-1 genome

1材料與方法

1.1材料和試劑

pHL1003，APV-1 cDNA克隆[見圖2(C)，ango區域只含有agno-1a，除去intron-4而缺失小t基因，德國Giessen大學Gerd Hobom教授提供]，新生小牛血清和DMEM(Gibco-BRL公司)，各種限制性內切酶及修飾酶(Takara公司，Biolab公司)，DNA Marker(Takara公司). 凝膠回收試劑盒(Axygen公司)，PCR引物合成和DNA 測序(上海桑尼生物科技有限公司)，脂質體Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司).

1.2方法

1.2.1pHL1003的制備

挑取-70℃超低溫冰箱保存的含有pHL1003質粒DNA的DH5α菌液接種于1 mL含amp的LB液體培養基，在37℃， 220 r/min 條件下培養12 h，采取SDS堿裂解法提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，質粒DNA保存于-20℃冰箱.

1.2.2表達綠色熒光的EGFPDNA片段

從質粒pEGFP-N1中擴增出編碼綠色熒光的EGFP-DNA片段，在GFP多克隆位點處設計一條上游引物，GFP-sense636 (5′TCGAGCTCAAGCTTCGAATTC T3′)，在EGFP序列下游設計一條下游引物，GFP-Antisense1535 (5′TATTAAGCTTTGTAACCATTATAAG CT3′)(引入HindIII酶切位點，下劃線部分).PCR體系總體積50 μL，含無菌水39 μL，10 × buffer 5 μL，10 μmol/L正反引物各1 μL，1 mmol/L dNTP 2 μL，2.5 U/μL Tag聚合酶1 μL，模板DNA 1 μL. PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s；58℃ 30 s；72℃ 1 min；30個循環；72℃ 5 min.所得PCR片段經試劑盒洗鹽后，用HindIII，BamHI雙酶切，膠回收試劑盒回收約894 bp的小片段.

1.2.3pHL1003-GFP載體片段構建

(a) pEGFP-N1質粒； (b) PCR擴增EGFP目的片段； (c) pHL1003：與野生型APV-1類同的cDNA重組克隆； (d) pHL1003-1： 刪除VP1,VP2,VP3的重組cDNA克隆； (e) pHL1003-GFP：構建的GFP熒光標記重組克隆 圖2　重組質粒的構建 Fig.2　Construction of the recombinant plasmide

運用PCR技術擴增出與野生型病毒APV-1相同的Ori區、早期編碼區和晚期Agno-1a區序列作為載體片段， 在VP-1下游設計一條引物，1003-sense2757(5′TTATAAGCTTCTCCCGAGATTGACA 3′)(引入HindIII酶切位點，下劃線部分)，VP-2上游設計一條引物，1003-Antisense850(5′TATTGGATCCACCTTAGTGCAGCT AC 3′)(引入BamHI酶切位點，下劃線部分).PCR體系總體積50 μL，含無菌水37.5 μL，10×buffer 5 μL，10 umol/L正反引物各1.5 μL，1mmol/L dNTP 1.5 μL，1 U/μL Tag聚合酶1 μL，25 mM MgCl21 μL，模板DNA 1 μL. PCR程序：95℃ 3 min；98℃ 20 s；60℃ 15 s；72℃ 3 min；30個循環；72℃ 6 min. 所得PCR片段經洗鹽試劑盒洗鹽后，用HindIII，BamHI雙酶切，膠回收試劑盒回收約5.6×103的大片段.

1.2.4禽類多瘤病毒熒光標記克隆pHL1003-GFP的構建

將上述獲得的目的片段與載體片段按5∶1 的比例混合，T4 DNA連接酶16℃連接過夜， 再轉化大腸桿菌DH5α，SDS堿裂解法提取質粒DNA后做酶切鑒定，篩選出正確插入熒光標記的重組克隆pHL1003-GFP.

1.2.5細胞培養及D N A 轉染

原代雞胚和鵪鶉胚成纖維細胞在含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養基中培養，并于37℃、體積分數5% C02飽和濕度條件下生長.用質粒純化試劑盒提取pHL1003-GFP和pHL1003質粒DNA，并對含量和純度進行測定.轉染前，各株細胞均以2×105/孔接種于35 mm的培養皿中，每孔加入2 mL DMEM培養液，37℃培養細胞密度達到80%；將3 μg 質粒DNA稀釋于無血清無抗生素的DMEM至終體積50 μL，取5 μL Lipofectamine2000稀釋于45 μL無血清無抗生素DMEM，輕輕振搖5 min，二者混合，室溫靜置20 min 后逐滴加入禽類胚胎成纖維細胞上，混勻，培養72 h.

1.2.6轉染后倒置熒光顯微鏡觀察細胞

轉染DNA 36、48、60、72 h后采用熒光顯微鏡在488 nm波長紫外光激發條件下觀察細胞中EGFP的表達情況.

2結果與分析

2.1重組載體的酶切鑒定

制備的載體和目的DNA片段經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶大小分別為5.6 kb和0.9 kb(見圖5)，將目的片段和載體片段連接、轉化和細菌培養，挑取陽性克隆，SDS堿裂解法提取質粒DNA后，用BamHI單酶切和HindIII，BamHI雙酶切檢測(見圖3)，選擇有插入目的DNA片段的克隆測序.

(1) 載體片段5.6 kb；(2) 目的片段894 bp；(3) 1kb Marker Fig.3　Preparation of the vector and the target DNA圖3　制備載體和目的片段DNA

(1) 陽性克隆的質粒DNA；(2) 陽性克隆BamH I酶切，(3)陽性克隆Hind III + BamH I雙酶切；4)1kb Marker 圖4　陽性克隆酶切鑒定 Fig.4　Identification of the positive clone

2.2重組克隆的測序鑒定：

雙向測序表明，重組克隆中插入了相應的EGFP目的片段. Blast比對分析表明pEGFP-N1質粒DNA中EGFP序列與重組克隆中的插入序列一致，證明APV-1cDNA重組EGFP克隆構建成功.

2.3細胞中重組質粒GFP的表達

重組克隆pHL1003-GFP質粒DNA轉入雞胚成纖維細胞后，在48 hpt可觀察到部分細胞表達EGFP； 72h后，表達EGFP的細胞數量逐漸增多，細胞中有較強的熒光蛋白表達 (見圖5).

a)72 h細胞表達GFP　　　　(b)72 h 可見光下細胞圖5　熒光顯微鏡觀察雞胚細胞熒光蛋白表達Fig.5　The GFP expression of CEF under fluorescence microscope

(a) 72 h細胞表達GFP　　　　(b) 72 h 可見光下細胞圖6　熒光顯微鏡觀察鵪鶉胚胎成纖維細胞熒光蛋白表達Fig.6　The GFP expression of QEF under fluorescence

圖7　激光掃描共焦顯微鏡觀察雞胚細胞熒光蛋白表達Fig.7　The GFP expression of CEF under confocal laserscanning microscopy

3討論

研究表明一些缺乏5′帽子結構的非典型病毒如小核糖核酸病毒和丙型肝炎病毒的翻譯合成起始，是依賴其5′端非翻譯區翻譯調控的順式作用元件(包括RNA的高級結構)，在一些關鍵的反式作用因子ITAFs(IRES trans-acting factors)的輔助下，直接招募核糖體小亞基到病毒mRNA的翻譯起始位點[7].能夠特異性引導核糖體識別mRNA內部序列和結構并與mRNA 結合從而起始翻譯的序列稱為內部核糖體進入位點序列(internal ribosome entry site，IRES) .

圖8　pL1下2順反子(Agno-1a+VP1)和3順反子(Agno-1a+VP2/3)線形圖 Fig.8　 Under pL1 2 cistron (Agno-1a + VP1) and 3 cistron (Agno-1a + VP2 / 3) Line Chart

禽多瘤病毒APV-1與猴空泡病毒(SV40)和其他哺乳動物的多瘤病毒都是通過啟動子上游的起始位點序列和大T抗原蛋白的先相互作用進行晚期mRNA轉錄調控. 在APV-1中，兩個啟動子PL1和PL2，相隔89 bp，晚期基因啟動子PL1調控的晚期基因轉錄通過選擇性拼接(intron-1/-2a(2b)/-3)可產生兩組四種多順反子mRNAs：Agno-1a+VP1(大量)和Agno-1a+VP2/3+VP1(少量)；Agno-1a+VP1(少量)和Agno-1b + VP2/3 + VP1(少量).分別翻譯出Agno-1a(大量)、Agno-1b、Agno-2a、Agno-2b、VP1(大量)、VP2、VP3蛋白(見圖8).內含子1，2a，3剪切后，產生最主要和占多數的多順反子Agno-1a+VP1的mRNA，翻譯出Agno-1a、VP1蛋白(見圖8-b)[4，5，6].內含子1和2a被剪切后，產生多順反子Agno-1a+VP2/3+VP1，翻譯出Agno-1a、VP2、VP3蛋白(見圖8-a)[ 4].對 APV 的晚期基因編碼的前導蛋白 Agno-1( 1a和 1b) 和 Agno-2( 2a 和 2b) 的結構和功能的深入研究，發現這些Agno蛋白與禽類多瘤病毒的晚期蛋白的表達調控有關[5].依據對APV-1的一系列研究結果的分析，推測在最主要的agno-1a+VP1雙順反子中Agno-1a蛋白可能作為ITAF輔助VP1的IRES調控VP1的翻譯，而該雙順反子的5′-UTR和agno-1a mRNA區域可形成特異的IRES，從而導致開始以依賴帽子結構的方式進行上游Agno-1a的翻譯switch到后期的由ITAF(Agno-1a)結合IRES介導的下游VP1的翻譯.為研究多順反子中上游Agno基因，特別是占主要數量的Agno-1a基因的表達對下游病毒結構蛋白基因表達的調控作用，設計和構建出與野生型病毒APV-1基因組結構相同的但在Agno-1a翻譯起始AUG區域插入含AUG起始碼的編碼7個氨基酸的具有最佳翻譯起始信號核苷酸的兩種APV-1 cDNA克隆突變體，轉染到雞胚細胞內觀察其對Agno-1amRNA下游VP蛋白翻譯的影響[8].用Western blot方法特異性顯示目標蛋白，通過條帶的位置(MW)和密度判斷蛋白的種類和表達數量，以此分析和研究多順反子翻譯起始調控機制.但此法也有其局限性，如過程較長，操作繁瑣，無法實時定位，定量困難等.

本研究設計用pEGFP-N1的GFP氨基酸編碼序列代替APV-1晚期結構蛋白下游VPs氨基酸編碼序列(VP2/3和VP1)，構建出帶有下游EGFP熒光標記報告基因的雙順反子重組克隆，可通過在熒光顯微鏡下定性和相對定量地觀察重組病毒基因表達熒光量的異同，結合Agno-1a的多種不同突變體可反映上游Agno-1a基因對GFP表達的影響. 轉染24 h后觀察雞胚和鵪鶉胚胎成纖維細胞，部分細胞(細胞核)表達了熒光. 轉染48 h后觀察，轉染成功的細胞(細胞核，細胞質)表達明顯的熒光.轉染72 h后觀察，發現較多胚胎細胞明顯表達較強的熒光. 轉染的陰性對照質粒pHL1003，細胞不表達熒光.表達有較強的熒光的樣本可采用ELISA綠色熒光蛋白酶聯免疫分析測定不同樣本中綠色熒光蛋白水平. 此方法較Western blot更加簡便易用，同批細胞可在不同轉染時間下持續地定性和相對定量地觀察的GFP的表達情況. 所構建的APV-1綠色熒光蛋白報告基因標記克隆均能較好地表達GFP并在488 nm下正常地激發出較強的熒光信號.在后續研究多順反子中的上游基因(如Agno-1a)對下游基因(如VPs)蛋白質翻譯的調控機制打下了良好的基礎.

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中圖分類號Q291

文獻標識碼A

文章編號1672-4321(2016)01-0039-05

基金項目教育部留學回國人員科研啟動基金[教外司留(2007)1108號]

作者簡介李勁(1962-)，男，副教授，博士，研究方向：分子病毒學，E-mail：jinli62@126.com

收稿日期2015-12-06