脊髓損傷后慢性中樞性疼痛大鼠血管內皮生長因子及一氧化氮合酶表達

陳錫棟　張鳳林　黃　翔　謝逐月

(遵義醫學院附屬醫院康復科，貴州　遵義　536000)

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脊髓損傷后慢性中樞性疼痛大鼠血管內皮生長因子及一氧化氮合酶表達

陳錫棟張鳳林黃翔謝逐月

(遵義醫學院附屬醫院康復科，貴州遵義536000)

〔摘要〕目的探討大鼠脊髓損傷后慢性中樞性疼痛血管內皮生長因子(VEGF)和一氧化氮合酶(NOS)表達變化。方法120只大鼠隨機分為單純椎板切除組(對照組)、脊髓損傷組(損傷組)、脊髓損傷后法舒地爾組(治療組)。免疫組化檢測脊髓損傷后1、3、7、14、21 d VEGF和NOS的表達；Western印跡法檢測各組各個時間點VEGF的表達。結果治療組BBB評分明顯優于損傷組(P<0.05)。免疫組化：脊髓損傷后VEGF的表達升高，于3 d達到高峰，然后下降；治療組VEGF的表達較損傷組降低(P<0.05)。脊髓損傷后NOS的表達升高，7 d達到高峰，然后下降；治療組NOS的表達較損傷組增高(P<0.05)。Western印跡法結果：脊髓損傷后VEGF的表達升高，于3 d達到高峰，然后下降；治療組VEGF的表達較損傷組降低。結論法舒地爾可以下調脊髓損傷后慢性中樞性疼痛大鼠VEGF的表達并上調NOS的表達，促進病癥恢復。

〔關鍵詞〕脊髓損傷；法舒地爾；血管內皮生長因子(VEGF)；一氧化氮合酶(NOS)

目前研究認為中樞神經系統(CNS)損傷后微環境中的抑制因子對神經元的再生起重要的抑制作用，這些因子主要是髓鞘相關抑制物(MAIs)〔1〕。研究發現MAIs通過激活Rho/Rho相關激酶(ROCK)通路，活化的血管內皮生長因子(VEGF)引起神經元生長錐的塌陷從而抑制軸突再生〔2〕。一氧化氮合酶(NOS)是目前最能反映中樞神經元再生的標志性蛋白分子〔3〕。法舒地爾是目前臨床唯一可用的ROCK選擇性抑制劑，由于ROCK參與了細胞分化與遷移、細胞平滑肌收縮、細胞骨架的重構等多種細胞功能〔4〕，因此法舒地爾可以通過抑制ROCK從而發揮廣泛而不同的藥理作用。本文擬通過探討法舒地爾對大鼠脊髓損傷后慢性中樞性疼痛VEGF和NOS表達影響。

1材料與方法

1.1實驗材料清潔級SD大鼠(上海斯萊克實驗動物公司)120只，體重200～220 g，雌雄不限。日本Olympus顯微鏡、德國Leica RM2245超薄切片機、滅菌鍋、液氮罐、漂片機、烤箱、溫控搖床、高速離心機、微量移液器、紫外分光光度儀、垂直板電泳轉移裝置、雙垂直電泳槽(福建醫科大學附屬第一醫院中心實驗室提供)。鹽酸法舒地爾注射液(川威)，規格30 mg/支(天津紅日藥業股份有限公司，批號H20040356)、兔抗大鼠VEGF一抗、兔抗NOS抗體(Santa Cruz，美國)；Polink-2puls免疫組化試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、Harris蘇木素液、麗春紅染色試劑(北京中杉公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)(MILLIPORE)(北京普利萊生物公司)。

1.2動物分組隨機分為單純椎板切除術切除組(對照組)，脊髓損傷組(損傷組)，脊髓損傷后慢性中樞疼痛治療組(治療組)，各40只。1、3、7，14，21 d 5個時間點被分成兩組，每亞組8只大鼠。脊髓損傷后治療慢性中樞疼痛1 h處理腹腔內注射鹽酸法舒地爾注入10 mg·kg-1·24 h-1，連續14 d。損傷組和對照組注射生理鹽水，管理方法和劑量相同的治療組。

1.3脊髓損傷動物模型的建立采用Allen重量法。老鼠的腹腔內注射10%水合氯醛麻醉(3~4 ml/kg)。麻醉成功之后，老鼠容易固定在手術臺上，在無菌條件下T10集中為切口，咬除T9~11棘突和葉片暴露脊髓和硬膜外；對照組不損傷脊髓組織。損傷組和治療組用重力打擊裝置，用質量10 g的金屬砝碼于5 cm高處，通過玻璃導向管自由墜落，撞擊置于硬腦膜上的圓柱形撞擊桿，造成脊髓的T10段損傷。成功的標準模型：鼠尾痙攣性搖擺和持續幾秒鐘，雙下肢癱瘓和形狀后和身體收縮顫動。硬腦膜的瘀紫，雙下肢的復蘇表現完全癱瘓。人工排尿和術后護理。

1.4疼痛檢測疼痛檢測運用熱輻射-甩尾法。第一步把實驗鼠固定，放置在特別制作的塑料筒當中，將尾巴露出在外，同時保持自然、下垂的狀態，等待鼠安靜20 min左右再進行測定。運用輻射熱源18.5 V，可隨意調節，采用8.75 mm放映式燈泡，通過透鏡聚焦，之后發射φ=4 mm的燈光束，主要照射尾部中下1/3的交界處皮膚，其光源要和尾部的皮膚緊緊相貼。用計時器(光源并聯電子計時器)進行同步記錄，記錄下照射的持續時間。當照射開始時，同時將秒表啟動，當動物的尾巴部分出現了躲閃的情況時要關閉光源，在同時停止計時。這里所記錄的時間間隔就是甩尾反應潛伏期(TFL)。

在正式測量前，要先進行電壓調節，讓TFL值保持在4~6 s，之后第5分鐘測定一次，取3次測定平均值作為基礎傷害性感受閾。如果鼠在鎮痛的作用下，TFL延長至超過了15 s，那么要停止照射，并且將15 s當成是甩尾潛伏期的峰值，避免照射的時間過長而傷害皮膚。

1.5神經功能評分取左右兩肢脊髓神經功能(BBB)評分平均值，作為每只大鼠的神經功能評分。由兩名熟悉BBB評分標準的非實驗人員進行評分，并詳細記錄。

1.6HE染色和免疫組化取材及切片準備各組分別于術后5個時間點取材，麻醉下剖胸，切取打擊處上下各0.5 cm，全長約1 cm，放入4%多聚甲醛溶液中固定過夜，石蠟包埋，片厚5 μm連續切片，行HE染色，光學顯微鏡檢查。

1.7Western印跡蛋白取材及保存各組分別于術后5個時間點行斷頭處死后在嚴格無菌操作下快速冰上剝離切取損傷段脊髓組織打擊處上下各0.5 cm，全長約1 cm，放入液氮罐保存后轉移至-70℃冰箱，用來提取蛋白質。

1.8免疫組化檢測VEGF和NOS的表達取石蠟切片行免疫組織化學染色。切片常規脫蠟至水；高壓鍋煮沸法修復抗原3 min(枸櫞酸鹽緩沖液)；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次每次2 min；3%H2O2去離子水孵育10 min后滴加過氧化物酶；PBS沖洗3次每次2 min，滴加相應一抗，4℃過夜；PBS沖洗3次每次2 min；滴加試1(Polymer Helper 即用型)后室溫孵育15 min；PBS沖洗3次每次2 min；滴加試劑2(poly-HRP抗鼠/兔IgG即用型)后室溫孵育15 min；PBS沖洗3次每次2 min；滴加DAB溶液顯色1 min；蒸餾水沖洗3次每次2 min；蘇木素核染0.5~1 min，自來水沖洗復染；梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；于損傷處為中心取視野光鏡下觀察蛋白的表達情況，各實驗組對比。以統一標本0.01 mmol/PBS緩沖液代替一抗作空白對照。

1.9Western印跡法測定VEGF蛋白的表達-70℃冰箱凍存脊髓組織加細胞裂解液(按每100 mg組織加入1 ml裂解液)，于冰上孵育后快速勻漿。在4℃下，以12 000 r/min，離心5 min后分裝上清液，測定蛋白濃度，取等量蛋白樣品50 μg行8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，然后將蛋白轉移至PVDF膜上，用溶有5%脫脂奶粉的洗滌緩沖液(TBST)封閉PVDF膜，放入溫控搖床(37℃)輕搖1 h；PVDF膜剪成適應大小，加入溶有5%脫脂奶粉的TBST稀釋VEGF一抗(1∶500)，PVDF膜于4℃下孵育過夜；加入溶有5%脫脂奶粉的TBST稀釋的相應二抗(1∶2 000)，放入溫控搖床(37℃)輕搖1 h；化學發光顯影及定影，掃描膠片后檢測和分析目的條帶的灰度值。

1.10統計學方法采用SPSS17.0統計軟件包進行單因素方差分析。

2結果

2.1行為學觀察結果與對照組相比，損傷組和治療組的BBB評分在各個時間點均降低(P<0.05)。損傷組和治療組運動功能隨著時間的變化均有所恢復；但治療組BBB評分高于損傷組，在損傷后7、14及21 d兩組差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　各組各時間點BBB評分,分，n=8)

與對照組比較：1)P<0.05；與治療組比較：2)P<0.05；下表同

2.2HE染色觀察結果脊髓損傷后慢性中樞性疼痛2 w后大鼠脊髓結構見圖1。對照組脊髓組織結構輪廓清晰，神經元結構較完整；損傷組脊髓組織結構紊亂、疏松，可見較明顯的結構空白區，膠質瘢痕組織形成，神經元結構不完整；治療組脊髓組織結構輪廓較損傷組清晰，壞死區域及膠質瘢痕組織均較脊髓損傷組少。

圖1　脊髓損傷后慢性中樞性疼痛2 w后大鼠脊髓結構(HE染色，×200)

2.3VEGF免疫組織化學檢測結果見表2。VEGF在各組各時間點均有陽性表達，在光鏡觀察下，胞質呈棕色或棕褐色者為陽性，而陰性對照組胞質呈藍色，無棕色或棕褐色表現。術后對照組VEGF有少量表達，隨時間變化無統計學意義(P>0.05)；損傷組1 d后VEGF表達即開始增高，于3 d達到高峰，隨后逐漸下降；與對照組相比，損傷組和治療組VEGF表達增

表2　各組各時間點VEGF表達的平均光密度

高，兩組1、3及7 d差異有統計學意義(P<0.05)；與損傷組相比，治療組VEGF的表達減少，兩組于1、3、7及14 d差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4NOS免疫組化結果NOS在各組各時間點均有陽性表達，在光鏡觀察下，胞質呈棕色或棕褐色者為陽性，而陰性對照組胞質呈藍色，無棕色或棕褐色者表現。免疫組化檢測結果顯示：對照組胞質顆粒染淺棕色，為弱陽性表達；損傷組胞質顆粒染棕色，為陽性表達；治療組胞質顆粒染棕褐色，為強陽性表達，表達較損傷組強。術后對照組NOS有少量表達，隨時間變化無統計學意義(P>0.05)；脊髓損傷1 d后NOS表達即開始增高；與損傷組相比，治療組NOS表達升高，兩組于7、14、21 d差異有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖2。

圖2　脊髓損傷后慢性中樞性疼痛7 d各組的NOS表達(DAB染色,×400)

時間對照組損傷組治療組1d0.219±0.0180.225±0.0202)0.230±0.0213d0.205±0.0170.285±0.0251)2)0.295±0.0227d0.200±0.0150.365±0.0381)2)0.552±0.0291)14d0.204±0.0160.285±0.0251)2)0.425±0.0201)21d0.203±0.0150.210±0.0182)0.375±0.0191)

2.5VEGF蛋白Western印跡檢測結果見表4和圖3。各組各時間點均可檢測出VEGF的表達，對照組VEGF有少量表達，

圖3　各組各時間點VEGF蛋白Western印跡結果

時間對照組損傷組治療組1d0.335±0.0200.853±0.0321)2)0.755±0.0251)3d0.327±0.0181.465±0.0401)2)1.182±0.0291)7d0.328±0.0161.250±0.0351)2)0.752±0.0201)14d0.325±0.0171.085±0.0261)2)0.415±0.0221)21d0.316±0.0150.550±0.0171)2)0.386±0.0191)

隨時間變化無統計學意義(P>0.05)；脊髓損傷1 d后VEGF表達即開始增高，于3 d達到高峰，隨后逐漸下降，至7 d仍高于對照組；治療組表達低于損傷組。三組差異于各時間點均有統計學意義(P<0.05)。

3討論

脊髓損傷后慢性中樞性疼痛的病理過程可分為原發性和繼發性損傷。脊髓繼發性損傷后由于脊髓組織發生出血水腫、免疫炎癥反應及毒性物質沉，繼而出現神經元壞死和凋亡、軸突脫髓鞘改變，最終形成膠質瘢痕組織〔5〕。由于脊髓損傷后慢性中樞性疼痛出現了上述改變，從而不利于神經元軸突的再生和功能的恢復。軸突生長抑制因子主要是通過結合共同受體即Nogo-66受體1(NgR1)，進而激活小GTP酶ras同源基因家族成員(Rho)，活化的Rho進而激活ROCK〔6〕。Rho激酶全稱是Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶，廣泛分布于人體各種組織，主要存在于細胞質，調整細胞骨架運動，以兩種同源性極高的異構體存在：ROCK1和VEGF，在神經系統中主要是VEGF。VEGF抑制劑如布洛芬、Y27632等通過抑制VEGF的活性而阻斷Rho信號轉導通路，可以促進成年大鼠脊髓損傷后慢性中樞性疼痛神經元軸突的再生和運動功能的恢復〔7〕。本實驗研究提示脊髓損傷后慢性中樞性疼痛VEGF表達上調而發揮抑制軸突再生的作用；法舒地爾可以通過抑制VEGF而促進脊髓損傷后慢性中樞性疼痛的軸突再生和功能的恢復。

NOS(生長相關蛋白43)主要表達于神經元軸突生長錐質膜面，可通過促進肌動蛋白聚集，增強生長錐的活力而促進軸突生長〔8〕。研究表明，高表達NOS可以增強中樞神經元軸突的再生潛能，在生長錐中，NOS可促進肌動蛋白的聚集，使生長錐在形態上更具有活力，并抵抗其回縮，利于神經的發育及軸突的再生〔9〕。本實驗結果提示法舒地爾可以通過上調NOS表達從而促進脊髓損傷后慢性中樞性疼痛的軸突再生和功能的恢復。法舒地爾為日本名古屋大學和旭化成株式會社合作研發的一種異喹啉磺酰類藥物，1995年在日本首次應用于臨床，主要用于防治腦血管痙攣和改善蛛網膜下腔出血的預后。于2004年我國批準了生產法舒地爾注射液，是目前臨床唯一可用的ROCK選擇性抑制劑。由于ROCK參與平滑肌收縮、細胞骨架的重構、細胞分化與遷移等多種細胞功能，因此法舒地爾可以通過制劑ROCK從而發揮廣泛的藥理作用。法舒地爾可以上調小鼠星形膠質細胞谷氨酸轉運從而促進星形膠質細胞中的肌動蛋白重構〔10〕，ROCK抑制劑在體外可促進皮質脊髓束(CST)的出芽，同時在體內可改善CST受損大鼠的運動功能〔11〕，從而為法舒爾的應用開辟了新的思路，本實驗也觀察到ROCK抑制劑法舒地爾可促進改脊髓損傷后慢性中樞性疼痛大鼠軸突的再生及功能的恢復。

4參考文獻

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〔2014-12-19修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R744.9

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1589-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.023

基金項目：遵義市衛生局科技計劃項目(No.30300099)

第一作者：陳錫棟(1977-)，男，碩士，主治醫師，主要從事康復研究。