低溫脅迫對荷那龍羅非魚內臟組織脂肪酸變化的影響

葛仲顯，陳彥君，陳　剛，張健東（甘肅省慶陽市水產工作站，甘肅慶陽745000）

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低溫脅迫對荷那龍羅非魚內臟組織脂肪酸變化的影響

葛仲顯，陳彥君，陳剛，張健東
（甘肅省慶陽市水產工作站，甘肅慶陽745000）

摘要：實驗以荷那龍羅非魚（Oreochromis hornorum）為研究對象，在室內控溫循環水族箱內，按照1℃/d的速度，將溫度分別從暫養的25℃，降到25℃、20℃、18℃、16℃、14℃、13℃、12℃幾個實驗溫度組進行低溫脅迫實驗，每隔10 d定期取樣，取樣5次，取背側肌、肝胰臟、腸和內臟脂肪組織四個組織的樣，來分析低溫脅迫對實驗對象所造成的影響。結果發現：在實驗過程中，腸和肝胰臟組織沒有明顯的變化規律；背側肌和內臟脂肪組織在實驗期間兩者SFA和MUFA都隨著取樣時間的延長，所占脂質的百分含量下降，各組間的差異顯著(<0.05)，PUFA百分含量上升(<0.05)，內臟脂肪組織SFA和MUFA下降，PUFA上升，差異極顯著水平(<0.01)。

關鍵詞：荷那龍羅非魚；低溫脅迫；氣相色譜

羅非魚由于其適應性強、生長周期短，在各省市有大面積的養殖，但是養殖過程中，由于自然界中季節更替、環境劇變或食物分布不均等原因，動物經常受到節律性或突發性脅迫。溫度脅迫，就是最為常見的一種環境脅迫因子，羅非魚對低溫的耐受能力相對較差，在10℃以下，就開始有死亡現象出現。由于動物對各種環境因子的承受能力有限，任何一種因子，超過它的耐受能力，就會影響生長狀況，甚至出現死亡。

低溫脅迫在植物中的研究較為深入，以魚類為研究對象的較少，梁友光等[1]對長吻鮠越冬的生理生化適應進行了比較的深入研究，王曉杰等低溫脅迫下許氏平鲉補償生長[2-5]也進行了相關的研究，進一步解釋了補償生長的可能機制[6]。常玉梅等[7-8]和丁雷[9]對鯉魚的低溫脅迫進行了研究，反映出低溫脅迫下鯉魚血液生理生化指標等所受到的影響。

在羅非魚中的低迫脅迫研究較少，本實驗以荷那龍羅非魚為研究對象，分別取背側肌、肝胰臟、腸和內臟脂肪組織作為樣品來分析低溫脅迫對實驗對象所造成的影響，實驗中沒有涉及補償生長，在幾種實驗溫度組內，持續長時間的取樣，對比分析，體內營養物質的利用順序和優先利用的組織，以期為相關的研究提供相應的理論數據參考和技術支持。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.2實驗試劑

已醚、濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、硼酸、甲醇、氯仿、氯化鈉、正已烷、氫氧化鉀、異辛烷、無水硫酸鈉等以上所用的藥品均為分析純。

1.3實驗器材

凱氏定氮儀、水浴鍋、離心機、索氏抽提儀、氣相色譜儀、氮氣吹干儀、粉碎機、渦旋振蕩器、旋轉蒸發儀、微量移液器等指標測量用具及實驗中常用的解剖用具。

1.4實驗方法

1.4.1實驗取樣方法實驗將在25℃下暫養2周的荷那龍羅非魚，在室內循環水族箱內進行分組實驗，實驗共設有7個溫度組，分別為25℃、20℃、18℃、16℃、14℃、13℃、12℃，其中以25℃組為對照。將暫養結束的魚，每個溫度組分90尾，設3個平行，每個平行組放養30尾，以1℃/d的速率開始從25℃降溫，降到所需的溫度組后，開始計時，取樣時間為0 d、10 d、20 d、30 d、40 d和50 d，共取樣6次，每個平行組取3尾魚。

取樣時取出的實驗對象用紗布擦干表面的水分，現場測量樣品實驗對象的全長，體長，然后稱取魚體體重。在冰盤中解剖，取出內臟團，用生理鹽水洗去附著血液，濾紙吸干后對其進行稱重，之后再分離出肝胰臟、去除內溶物的腸組織、內臟中脂肪組織，同樣用濾紙吸干后對其稱重。最后，取魚的背側肌肉，用手術剪后，取下，稱重。所有的樣品取完后均采用-20℃冰箱保存。長度精確到0.1 cm，重量精確到0.01 g。

1.4.2樣品處理方法在105℃下，烘干，測定水分含量后，將肌肉樣粉碎。取0.3 g烘干之后的樣品，采用氯仿-甲醇法，于15 ml的離心管中,加CHCL3/CH3OH/H2O= 1∶2∶0.8的混合液7.6 ml，超聲波提取2 min,劇烈震搖5 min，3 000 r/m離心10 min，取上清液于分液漏斗中。重復2～3次，合并液體，向分液漏斗中加入6 ml CHCL3,使CHCL3/CH3OH/H2O=2∶2∶0.8，震搖30 s，再向分液漏斗中加飽和氯化鈉水溶液6 ml，使CHCL3/CH3OH/H2O=2∶2∶1.6，震搖30 s，分層后，下層旋轉蒸發至恒重，得粗脂肪，冷凍保存[10]。其他組織采用索氏抽提法提取所含有的脂類物質。

皂化方法：向冷凍保存的總脂中加2 ml氫氧化鉀-甲醇(4:1），充N2后，于60℃水浴皂化2h，皂化液轉移至15 ml的離心管中，用HCL調pH<1,加飽和氯化鈉水溶液1ml，用氯仿2ml∶正己烷(1∶4)洗樣品瓶合并到離心管中，渦流振蕩，離心4000r/m10min，取上層分析[10-30]。

皂化之后的樣品采用，GB-T 17376-2008的方法采取酯交換法處理，得到甲酯化之后的樣品，用Aligent 7890GC氣相色譜儀測定脂肪酸的組成。

處理條件如下：HP-FFAP的色譜柱，進樣口溫度250℃，分流比50∶1，流速1.8 ml/min，檢測器溫度270，FID檢測器，氫氣流速35ml/min，氮氣流速35 ml/min，空氣流速350 ml/min。升溫程序：起始溫度110℃，以8℃/min的速度升至220℃，保持16 min。

氣相色譜的測定結果，采用面積歸一化法，測定各種脂肪酸的百分含量[11]。

具體的方法如下：

校正因子的計算：第i組分的校正因子按下式計算：

fi—第i組分脂肪酸甲酯的校正因子；

Ci—標準樣中組分i的濃度；

Ai—標準樣的組分i的色譜峰面積。

樣品中各脂肪酸的質量分數按下式計算：

wi—某脂肪酸的質量分數％；

∑(fi·Ai)—所有組分的校正因子與色譜峰面積之和。

1.4.3數據處理方法實驗所得到的所有的實驗數據均采用SPSS17.0軟件進行方差分析、Turkey法進行多重比較。

2　結果與討論

2.1低溫脅迫對形態學指標的影響

實驗期間，除對照組沒有明顯的變化規律外，其他各實驗組的實驗對象肝體指數、臟體指數和肥滿度都隨著取樣時間的延長而下降，起始值相比差異顯著(<0.05)。

2.2低溫脅迫對肌肉成分的影響

肌肉成分為的水分含量隨取樣時間的延長，水分所占百分含量上升，溫度越低，上升幅度越大，25℃沒有變化，水分含量差異不顯著，其他的各個溫度組，起始值相比差異顯著(<0.05)。粗脂肪含量表現出和水分含量不同的變化趨勢，隨著取樣時間的延長，含量下降，溫度越低下降越快，和起始時的含量相比差異顯著(<0.05)。

2.3低溫脅迫對體內組織脂肪酸成分的影響

2.3.1低溫脅迫對肝胰臟脂肪酸成分的影響肝胰臟中脂肪酸的共測得25種，其中命名的有22種，所有碳原子的分布為12～24個碳原子之間，含量最多的是16 和18個碳原子的脂肪酸，其中SFA的含量變化范圍為20.99％～48.49％，UFA的變化為33.08％～60.57％，MUFA從12.92％～36.98％，PUFA從18.46％～28.21％。SFA的均值為37.18％，UFA的均值為52.18％。

雙因素的方差分析的結果得知，溫度和取樣天數均對結果產生了極顯著的影響（<0.01）。SFA的變化在10 d取樣時，含量最高，在六次取樣過程中，有兩個高峰出現，分別是10 d和40 d，數據差異極顯著。所有的溫度組有先上升，后下降，再上升，后下降的趨勢。在相同的取樣次數下，20℃數值差異最大。25℃沒有明顯變規律。

單不飽和脂肪酸也有兩個峰值出現，分別在0 d、30 d的兩次樣時，整體趨勢是先下降后上升，最后下降，各組值的結果差異極顯著。但是在相同的取樣時間時，各溫度組的規律卻是先上升，后下降，再上升的趨勢，變化規律不明顯。

PUFA除了對照組25℃之外，其余幾個組均有明顯的規律呈現出來，在10 d、40 d取樣時，出現數值高峰，整體的趨勢是先上升，后下降，再上升，最后回落。各取樣結果間的差異極顯著。在不同的取樣溫度下，各組沒有明顯的規律出現。n-3 PUFA、n-6PUFA沒有體現出明顯的規律。

2.3.2低溫脅迫對腸脂肪酸成分的影響對魚腸組織的脂肪酸進行分析時，總共發現25種脂肪酸，其中命名的有22個，碳原子數分布范圍12～24之間，豐度最高的是16和18碳的脂肪酸，實驗期間，飽和脂肪酸（SFA）的變化范圍27.25％～51.08％，不飽和脂肪酸（UFA）的變化范圍為40.21％～55.18％，其中單不飽和脂肪酸（MUFA）為含量變化范圍為20.42％～30.07％，多不飽和脂肪酸（PUFA）的變化范圍為16.09％～30.87％見圖1、2。

圖1　低溫對A組魚體腸組織SFA含量的影響

圖2　低溫對A組魚體腸組織MUFA含量的影響

由雙因素的方差分析結果得知，SFA的變化受溫度的和天數的影響，各組值之間差異極顯著。在相同的溫度，不同的取樣時間下，飽和脂肪酸先上升后下降，和對照組相比，在較低的溫度組，上升的趨勢不明顯。對應相同的取樣時間時，組間的差異不明顯。

由雙因素的方差分析結果得知，MUFA的變化受溫度的和天數的影響，各組值之間差異極顯著。MUFA在相同的取樣溫度下，25、20℃有先下降，后上升再下降的趨勢，從18℃開始，后面的幾個溫度組，隨著取樣時間的延長，含量極顯著下降，沒有上升的趨勢。而在相同的天數，不同的溫度下取樣時，隨著溫度的下降，MUFA的含量呈現出了明顯的下降趨勢，而且溫度越低，含量越低。

圖3　低溫對A組魚體腸組織PUFA含量的影響

由上圖可以可出，魚腸中的PUFA的變化規律是隨著取樣時間的延長，含量顯著上升，不同的溫度組間，溫度越低，含量越高。

2.3.3低溫脅迫對內臟脂肪組織脂肪酸成分的影響A組魚的內臟組織中含有21種脂肪酸，不含有C24∶0，碳原子分布范圍與上述結果相同，為12～24個碳原子之間，含有豐富的16和18個碳原子的脂肪酸，C16∶0（棕櫚酸）20.06％～23.79％、C16∶1（棕櫚烯酸）3.91％～5.89％、C18：0（硬脂酸）0.11％～6.08％、C18：1（油酸）25.54％～29.93％、C18∶2（亞油酸）0.22％～17.38％、C18∶3（亞麻酸）0.10％～1.25％、EPA（二十碳五烯酸）0.24％～0.89％、DHA（二十二碳六烯酸）0.91％ ～3.69％。SFA、UFA、MUFA、PUFA的變化范圍分別為27.42 ％ ～34.92％、43.69％ ～61.82％、35.49％ ～40.53％、5.30％～23.31％。

圖4　低溫對A組魚體內臟脂肪組織SFA含量的影響

由圖4可以看出，對照組在整個實驗過程中，SFA沒有明顯的變化規律，其他各實驗組的SFA含量都有下降的趨勢，而且14℃以下的實驗組下降的更加明顯，特別到第4次實驗取樣時，內臟內很少有脂肪組織，所以相比其他組織的樣，只有3次樣，可能為低溫過程中身體的各種代謝提供能量，消耗較大。

圖5　低溫對A組魚體內臟組織MUFA含量的影響

由圖5可以看出，對照組的MUFA含量變化較大，沒有明顯的變化規律，其他的實驗組的規律和SFA相似，有明顯的下降趨勢，溫度越低下降越明顯。MUFA和SFA的結果來看，各組之間的差異更大，除對照組外，各組雖然有相同的變化趨勢，但組間表現出來的數值差異也很大，可能的原因是飽和脂肪酸代謝的中間產物為單烯酸。

圖6　低溫對B組魚體內臟組織PUFA含量的影響

由圖6可以看出，PUFA表現和SFA、MUFA完全相反的規律，這和肌肉中PUFA表現的規律相同，都隨取樣時間的延長，所占的百分數上升，可能是因為SFA和MUFA被利用，導致含量上升，或者其他更深層次的原因存在，實驗中未能發現。

3　結論

實驗結果發現，在不同的強度的低溫脅迫下，各取樣時間點間差異明顯，肝體指數、臟體指數和肥滿度幾個形態學指標都隨著取樣時間的延長而下降；肌肉粗水分上升，粗脂肪含量下降，粗蛋白在實驗條件下，沒有發生明顯的變化。

荷那龍羅非魚的四種組織中脂肪酸的變化也表現明顯的規律，肌肉和內臟脂肪組織中SFA和MUFA下降，PUFA上升；腸和肝胰臟中脂肪酸變化沒有規律。在低溫脅迫下，荷那龍羅非魚可能優先利用內臟脂肪組織和肌肉中的能量，出于對臟器的保護作用最后利用肝胰臟和腸中存在可利用能量。

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作者簡介：葛仲顯（1985-），男，甘肅慶陽人，農藝師，主要從事水產方面工作。

中圖分類號：S912

文獻標識碼：B

文章編號：1006-799X(2016)01-0069-04