120例耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候與基因突變的研究

黃穎新　潘景芝　汪　洋　閆　娜　孫集思

長春市傳染病醫(yī)院，吉林　長春　130123

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120例耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候與基因突變的研究

黃穎新潘景芝汪洋閆娜孫集思

長春市傳染病醫(yī)院，吉林長春130123

【摘要】目的：通過對耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候與耐藥基因突變的探討，初步明確耐多藥肺結(jié)核客觀化指征。方法：選擇120例耐多藥肺結(jié)核患者，利用現(xiàn)代基因芯片檢測技術(shù)，測定分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥的基因突變位點，并分析比較其在各中醫(yī)證候間出現(xiàn)的幾率。 結(jié)果：利福平耐多藥肺結(jié)核基因突變位點主要集中于rpoB-531(62.50%)和rpoB-526(19.17%)二個位點，其中在rpoB-531基因突變位點上，陰虛火旺證、氣陰兩虛證比肺陰虧虛證、陰陽兩虛證發(fā)生率顯著增高；在rpoB-526基因突變位點上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證發(fā)生率明顯增高。異煙肼耐藥基因在KatG315基因突變位點上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證發(fā)生率顯著增高；在inhA15基因突變位點上，陰陽兩虛證比肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證發(fā)生率明顯增高。結(jié)論：耐多藥肺結(jié)核利福平耐藥基因位點rpoB-526和/或KatG315突變可作為肺陰虧虛證的辨證指征，inhA15突變作為陰陽兩虛證的辨證指征，rpoB-531突變可作為陰虛火旺證、氣陰兩虛證的辨證指征。

【關(guān)鍵詞】耐多藥肺結(jié)核；中醫(yī)證候；基因突變

2007年我國被世衛(wèi)組織列為全球25個耐多藥結(jié)核病和嚴重耐多藥結(jié)核病最優(yōu)先控制的國家之一，且位居第一位。耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)已成為世界范圍最為嚴重的流行疾病，其治療費用多，治愈率低，死亡率高，是結(jié)核病控制所面臨的最大難題[1]。證候是中醫(yī)臨床診斷和治療的邏輯起點，是辨證論治的核心，加強揭示規(guī)律和本質(zhì)的中醫(yī)證候?qū)W研究具有重要的意義[2]。本研究選取120例耐多藥肺結(jié)核病例，應(yīng)用現(xiàn)代分子基因芯片檢測技術(shù)分析利福平、異煙肼耐藥基因突變位點與中醫(yī)證候的關(guān)系，初步明確耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候客觀化指征，為提高辨證論治水平奠定基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2014年1月至2014年12月住院及門診耐多藥結(jié)核病患者120例，其中男97例，女23例。年齡18～65歲，平均年齡(45.64±15.55)歲，病程3～600個月，平均病程(56.24±31.52)月。所有患者均符合《耐藥結(jié)核病防治手冊》[3]關(guān)于耐多藥肺結(jié)核的診斷，以及國家中醫(yī)藥管理局頒布的《中醫(yī)證候診斷標準》[4]、《中藥新藥臨床研究指導原則》[5]等關(guān)于“肺癆(肺結(jié)核)”的診斷標準。排除標準：①罹患各系統(tǒng)重大疾病、長期服用免疫調(diào)節(jié)劑等可能干預中醫(yī)證候判斷的患者；②妊娠期或哺乳期婦女、精神病患者；③合并肺外結(jié)核病者。

1.2中醫(yī)證候診斷標準①肺陰虧虛證。主癥：干咳，盜汗，手足心熱；次癥：痰中帶血絲或血點，咳聲短促，胸部隱隱作痛，口燥咽干，顴紅，皮膚干灼；舌紅少津，脈細或細數(shù)。②陰虛火旺證。主癥：嗆咳氣急、午后潮熱、盜汗；次癥：時時咯血色鮮紅，形體消瘦，五心煩熱，骨蒸，失眠，顴紅，口渴，胸脅掣痛，痰少質(zhì)粘或痰黃稠量多，口燥咽干；舌紅干，苔薄黃或見花剝苔，脈細數(shù)。③氣陰兩虛證。主癥：氣短聲低、午后潮熱、自汗與盜汗并見；次癥：咳痰清稀、咳嗽無力，痰中夾血血色淡紅，神疲乏力，畏風怕冷，納呆，顴紅，面色晄白；舌光淡，邊有齒印，脈細弱而數(shù)。④陰陽兩虛證。主癥：形寒肢冷，自汗，盜汗；次癥：潮熱，五更泄瀉，面浮肢腫，咳逆喘促少氣，咯痰色白，痰中帶血絲色暗淡，男子遺精，女子經(jīng)少或經(jīng)閉；舌質(zhì)光淡甚者隱紫，少津，脈細數(shù)或虛大無力。以上以主癥必備其中兩項，次癥兼具兩項以上，綜合舌、脈象即可診斷，均由三位副主任中醫(yī)師以上職稱專家共同進行判斷。120例耐多藥肺結(jié)核患者中肺陰虧虛證者11例，其中男9例，女2例，年齡20～64歲，平均年齡(44.09±16.18)歲，病程6～580個月，平均病程(57.18±30.96)月；陰虛火旺證者49例，其中男39例，女10例，年齡18～64歲，平均年齡(46.33±14.65)歲，病程3～590個月，平均病程(56.07±29.45)月；氣陰兩虛證者46例，其中男38例，女8例，年齡18～65歲，平均年齡(45.87±16.21)歲，病程5～600個月，平均病程(57.58±31.22)月；陰陽兩虛證者14例，其中男11例，女3例，年齡19～65歲，平均年齡(46.23±15.34)歲，病程3～590個月，平均病程(57.41±32.15)月。各組患者男女比例，平均年齡以及平均病程等一般資料比較，差異均不具有統(tǒng)計學意義，組間具有可比性(P>0.05)。

1.3基因芯片方法選用Evidenceinvestigator-生物芯片儀(英國朗道實驗診斷有限公司生產(chǎn))。核酸提取：取 2ml痰標本于標本消化管內(nèi)，加入NaOH-NALC 2ml。室溫靜置15min。提取1ml的標本處理液離心5min(12000r/min)共2次。向離心管內(nèi)加入80μl核酸提取液，渦旋振蕩混勻后移入核酸提取管。將核酸提取管于超聲振蕩器中震蕩15min。待水浴鍋溫度達到 95℃以上后，將核酸提取管放入其中處理5min。取出后離心1min(12000r/min)。擴增：將PCR擴增試劑1、2、3分裝擴增管中，18μl/管，每個管中加入2μl 模板DNA、陽性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品，做好標記。將擴增管放入擴增儀以下表的程序擴增。雜交：根據(jù)樣品數(shù)目(n) 取2n個PCR管置于PCR架上，排成兩排，同一列編排為一組，分別向PCR管內(nèi)加入9μl雜交緩沖液；取出PCR產(chǎn)物，分別向列排管中加入反應(yīng)體系一3μl，在上側(cè)管內(nèi)加入3μl對應(yīng)體系二充分吸打混勻，在下側(cè)管內(nèi)加入3μl對應(yīng)體系三充分吸打混勻，各反應(yīng)體系共計15μl。將雜交混合物置于PCR儀上95℃加熱5min，待其變性后立即放入冰水混合物中冰浴3min。吸取13.5μl雜交混合物加入雜交反應(yīng)盒芯片點陣中，密封雜交盒。將雜交盒放入50℃預熱20min的雜交儀中；50℃雜交2h，轉(zhuǎn)速5r/min。讀取：取出雜交反應(yīng)盒組芯片，放入洗干儀進行洗滌甩干。將處理好的芯片放入掃描儀，讀出結(jié)果。

1.4觀察指標觀察結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥相關(guān)基因突變位點在中醫(yī)各證候間出現(xiàn)的幾率。

1.5統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)采用SPSS 12. 0軟件進行統(tǒng)計學處理和分析，其中計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1耐多藥肺結(jié)核利福平耐藥基因位點與中醫(yī)證候的相關(guān)性分析利福平耐多藥肺結(jié)核基因突變位點主要集中于rpoB-531(62.50%)和rpoB-526(19.17%)二個位點，其中在rpoB-531基因突變位點上，陰虛火旺證、氣陰兩虛證與肺陰虧虛證、陰陽兩虛證比較，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明陰虛火旺證、氣陰兩虛證與肺陰虧虛證、陰陽兩虛證比較，其rpoB-531基因突變發(fā)生率顯著增高，提示rpoB-531基因突變可作為陰虛火旺證和氣陰兩虛證的基因辨證特征之一；在rpoB-526基因突變位點上，肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證比較，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證比較，其rpoB-526基因突變發(fā)生率明顯增高，提示rpoB-526基因突變可作為肺陰虧虛證的基因辨證特征之一。具體見表1。

表1　耐多藥肺結(jié)核利福平耐藥基因位點與中醫(yī)證候的相關(guān)性比較　[例(%)]

注：與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證比較，#P<0.05；與肺陰虧虛證、陰陽兩虛證比較，△P<0.05。

2.2耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候不同位點基因突變發(fā)生率的比較耐多藥肺結(jié)核異煙肼耐藥基因在KatG315基因突變位點上，肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證比較，統(tǒng)計學有極顯著性差異(P<0.05)，說明肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證等三型比較，其KatG315基因突變發(fā)生率更高，提示KatG315基因突變可作為肺陰虧虛證的基因辨證特征之一；在inhA15基因突變位點上，陰陽兩虛證與肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證比較，有極顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明陰陽兩虛證與肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證比較，其inhA15基因突變發(fā)生率明顯增高，提示inhA15基因突變可作為陰陽兩虛證的基因辨證特征之一。具體見表2。

表2　不同中醫(yī)證候異煙肼耐藥

注：與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證比較，#P<0.05；與肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證比較，△P<0.05。

3討論

耐藥結(jié)核病是指經(jīng)體外藥物敏感等試驗證實，結(jié)核分枝桿菌對一種或多種抗結(jié)核化學治療藥物耐藥，目前共分四大類：單耐藥結(jié)核病、耐多藥結(jié)核病、多耐藥結(jié)核病以及廣泛耐藥結(jié)核病。耐多藥結(jié)核病(簡稱MDR-TB)是指結(jié)核分枝菌經(jīng)體外證實至少同時對利福平、異煙肼兩種以上抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥。結(jié)核分枝桿菌發(fā)生耐藥的機制包括靶結(jié)構(gòu)基因突變、藥物失活酶作用、細菌胞壁通透性改變和代謝途徑改變等多種模式，而目前已證實的主要機制是由于菌內(nèi)藥物作用靶編碼基因突變所致[6]。多項研究表明利福平的耐藥發(fā)生與RNA聚合酶β亞基的編碼基因rpoB突變密切，異煙肼的耐藥發(fā)生與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因katG的缺失和突變及烯酰基還原酶編碼基因inhA基因突變高度相關(guān)[7]。

基因芯片技術(shù)以其具有高通量、簡便、微縮、平行化、集約化等方面的優(yōu)點，中醫(yī)藥臨床和研究領(lǐng)域如中醫(yī)證候研究、中藥藥理學研究、中藥有效成分篩選、中藥毒性及不良反應(yīng)研究等方面被廣泛應(yīng)用，在分子生物學與中醫(yī)藥學研究之間架起了一座技術(shù)橋梁，為中醫(yī)藥客觀化和標準化研究提供了技術(shù)上的保障。結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核化學治療藥物產(chǎn)生耐藥的最主要機制為細菌菌體內(nèi)藥物作用靶編碼基因的發(fā)生突變所致，利福平耐藥的產(chǎn)生與結(jié)核菌RNA聚合酶β亞基的編碼基因rpoB突變密切相關(guān)，異煙肼耐藥與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因katG的缺失、突變及烯酰基還原酶編碼基因inhA基因突變高度相關(guān)，因此，通過利用基因芯片耐藥檢測技術(shù)，探討耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候與利福平、異煙肼耐藥基因突變位點之間相關(guān)性和內(nèi)在聯(lián)系，將有助于闡明基于基因水平的耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候之本質(zhì)。通過耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候本質(zhì)和規(guī)律的研究，將有助于了解其疾病的病因、病機，為臨床辨證提供參考、證候標準的修訂與完善提供依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，利福平耐多藥肺結(jié)核基因突變位點主要集中于rpoB-531和rpoB-526二個位點，其中在rpoB-531基因突變位點上，陰虛火旺證、氣陰兩虛證比肺陰虧

虛證、陰陽兩虛證基因突變發(fā)生率顯著增高；在rpoB-526基因突變位點上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證突變發(fā)生率明顯增高。異煙肼耐藥基因在KatG315基因突變位點上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽兩虛證基因突變發(fā)生率顯著增高；在inhA15基因突變位點上，陰陽兩虛證比肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證基因突變發(fā)生率明顯增高。李桂蓮等[8]分析了30株利福平耐藥菌株的rpoB基因突變情況：總突變率為96.7%，其中rpoB 531突變率為70.0%，rpoB 526突變率為16.7%，利福平MIC≥32.00μg/ml與0.500～16.00μg/ml相比，菌株rpoB 531和rpoB 526基因位點的突變發(fā)生率高，推斷rpoB基因突變與利福平高水平耐藥有關(guān)。孫鳳丹等[9]利用PCR-SSCP方法發(fā)現(xiàn)KatG菌耐異煙肼臨床分離株是主要的基因突變類型，說明KatG在INH耐藥中起主導作用，但某些菌株的耐異煙肼可能與KatG無關(guān)，而與inhA基因突變有關(guān)。因此，KatG基因突變是異煙肼耐藥性的重要分子機制，inhA基因突變是重要的輔助機制。

綜上所述，耐多藥肺結(jié)核利福平耐藥基因位點rpoB-526和/或KatG315突變可作為肺陰虧虛證的辨證指征，inhA15突變作為陰陽兩虛證的辨證指征，rpoB-531突變可作為陰虛火旺證、氣陰兩虛證的辨證指征。

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(收稿日期：2016.01.09)

【中圖分類號】R259

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)06-0078-03

通信作者：孫集思(1976-)，男，本科學歷，副主任醫(yī)師，主要從事結(jié)核病臨床治療方面的研究，E-mail：407282555@qq.com

基金項目：吉林省中醫(yī)藥科技項目(2014-ZC78)；“十二五”國家科技重大專項“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”專項課題(2012ZX0005007)。