生命科學學院開設研究生掃描電鏡課程的探索

謝麗　李海燕

【摘要】作為對超微結構進行研究的一種重要手段，掃描電子顯微鏡在生命科學領域的應用受到高度重視。作者以“突出應用，簡化原理、立足平臺儀器”為原則，從課程目標、課程內容、課程完成的情況等方面，探索為生命科學學院研究生開設掃描電鏡課程的創新方法。

【關鍵詞】掃描電子顯微鏡 生命科學 研究生課程 創新方法

【基金項目】由“中央高校基本科研業務費專項資金”重點研究基地團隊建設項目資助的，項目編號：lzujbky-2014-bt05。

【中圖分類號】G64 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-3089（2016）06-0016-02

生命科學的理論和應用歸根到底來自實驗，并由實驗檢驗。近30年來，生命科學的發展極其迅速，取得了一系列令人矚目的成就。其中，大型精密儀器的作用功不可沒。大型儀器為研究生命物質的作用和功能提供了定位、定性、定量，甚至實時的數據和圖片，為生命科學的重大發現提供著強有力的實驗證據，決定性地引導著相關研究領域的發展方向。掃描電子顯微鏡是一種用電子束掃描樣品表面，通過電子束與樣品的相互作用產生多種效應，從而獲取樣品表面放大的形貌像。這個像是在樣品被掃描時按時序建立起來的，其放大倍率從幾倍到幾十萬倍連續可調，景深大，分辨率高，保真度好。在立體、清晰、多觀察角度等方面均較普通光學顯微鏡有不可比擬的優越性。作為對超微結構進行研究的一種重要手段，在生命科學研究領域的應用受到高度重視。因此，為研究生設置掃描電鏡課的重要意義不言而喻。

1.課程內容的設置

本門課程是以蘭州大學研究型生命科學大型儀器共享平臺為依托，授課所使用的Hitachi 3400N型掃描電鏡隸屬于該平臺，授課團隊的各成員均來自于該平臺，且具有較豐富的生命科學的教育和科研背景，授課的對象也是生命科學各專業的研究生。基于此，并針對將經常到平臺使用掃描電鏡的各專業研究生的學習特點和科研任務，本課程內容的設置原則是：突出應用，簡化原理、立足平臺儀器。課程內容強調掃描電鏡的功能及其各項性能指標在生物體系內的科學意義，簡化儀器本身復雜的物理化學原理。這種將儀器功能和生物學特征直接聯系的課程，拉近了掃描電鏡和學生之間的距離。

1.1 課程目標

對授課對象而言，本課程的目標主要分三個方面：理論知識目標、能力目標和素質目標。理論知識目標是讓學生了解Hitachi 3400N型掃描電鏡的工作原理、儀器構造，掌握重要的儀器性能指標和相關的儀器術語；掌握基本的樣品制備方法；掌握獲取優質掃描電子像的方法。能力目標是讓學生能夠正確地使用和操作儀器，能夠簡單排除故障，學會知識遷移的能力，從而多角度、多參數、多指標的去驗證實驗中所得到的相同的理論結果。素質目標是培養學生的安全意識；培養學生精益求精、實事求是、一絲不茍的科研素質；培養學生的創新素質。對授課者及所屬儀器共享平臺而言，其目標是增強管理人員的業務素質，緩解平臺技術力量不足，提高掃描電鏡的利用效率等。

1.2 課程內容的設置

本課程的內容見圖1。課程內容分課堂講授理論知識和上機實訓兩個部分。本門課程總學時為18個學時，理論知識占6個學時，上機實訓占12個學時。理論知識采取集中授課的方式進行，上機實訓按專業特點和研究方向分為植物組、動物組、微生物組和細胞組，各組獨立制樣，上機實訓；按實驗目的、實驗步驟、實驗結果和討論的內容完成并提交實驗報告；最后分組討論。

2.課程的完成情況及結果

2.1 課程完成情況

順利完成了理論知識講授部分。因授課人員和掃描電鏡資源的缺乏，選課人數控制在15人以內，實際選課人數為15人。把15人按研究方向分為四組，分組情況及各組的實驗目的見表1。按組進行上機實訓，以下將對上機實訓的情況做相關陳述。

（1） 樣品制備方法的探索

探索樣品的制備方法，該任務由微生物組和植物組來完成。微生物組所用材料為檸檬酸桿菌，樣品制備實驗共分四組，考察固定次數、固定時間和脫水劑濃度梯度、脫水時間對掃描圖像的影響，各組的實驗步驟和所用材料、試劑見表2。植物組所用材料為擬南芥葉片和紫萍葉片，樣品制備共分三組，考察三種不同的樣品處理方式對掃描圖像的影響，各組的實驗步驟和所用材料、試劑見表3。

動物組所用材料為阿拉善雙峰駝的頭部皮膚，樣品處理不分組，該實驗步驟和所用材料、試劑見表4。動物細胞組因材料不同樣品制備被分為兩組，第一組的材料是小鼠神經瘤母細胞，為貼壁培養的細胞，其樣品制備的方法與植物組中的化學試劑處理組相同；第二組的材料是白血病細胞系（HL-60），為懸浮培養的細胞，其樣品制備的方法與微生物組中的常規組相同。

以上各種樣品制備過程中用到的化學試劑均為分析純，干燥所用的儀器為日立冷凍真空干燥儀（ES-2030），噴金所用的儀器為日立離子濺射儀（E-1010）。

（2）體會SEM各儀器參數的改變對圖像質量的影響

影響掃描電鏡圖像質量的因素主要有三部分：第一部分是儀器的工作狀態。獲取圖像時要使儀器處于正常的工作狀態，所謂儀器的正常工作狀態是指：鏡筒足夠清潔、電子系統的安裝和調節無誤、準確合軸對稱，能進行高倍聚焦、電噪音足夠小。第二部分是樣品材料要無水無揮發性物質，具有一定的機械輕度，能耐受電子束的轟擊，具有導電性，能產生足夠的信號。

掃描電鏡圖像質量的高低除了儀器本身的狀態和樣品材料的狀態問題外，更主要的是操作條件，也就是儀器參數的設置決定的。應根據不同的樣品選擇最佳的掃描參數，才能得到高質量的圖像。這些儀器參數主要有：加速電壓、掃描速度、工作距離、探針電流、物鏡光闌孔徑、信噪比和象散校正。

上機實訓的主要目的就是體會SEM各儀器參數的改變對圖像質量的影響，并學會如何設置各個參數。

2.2結果

（1）樣品制備的探索結果

豐島等人的研究表明，樣品經戊二醛固定后乙醇梯度脫水，樣品的收縮率與脫水時間有很大的關系，脫水時間越長，收縮越大，反之則越小。特別是樣品直接進行70%-90%-100%的乙醇梯度脫水，每步的脫水時間控制在5min以內幾乎沒有收縮。嬌弱樣品的掃描電鏡制樣中，常規的固定方法是采用戊二醛和鋨酸雙固定，固定程序操作復雜且耗時，此外，鋨酸昂貴且需要進口。徐柏森等人使用戊二醛一種固定劑，縮短固定時間至30min，在固定后直接進行70%-90%-100%的乙醇梯度脫水，每個濃度脫水1次，每次5min，獲得了良好的掃描電鏡圖片。在上述研究結果的基礎上，本次課程讓微生物組把樣品制備實驗分為了四組，第三組、第四組都使用戊二醛一種固定劑，固定時間縮短至20min，在固定后直接進行70%-90%-100%的乙醇梯度脫水，每個濃度脫水1次，第三組每次5min，第四組每次2min。也均獲得了良好的掃描電鏡圖片。

（2）體會改變SEM各儀器參數對電鏡圖像的影響

各組根據自己材料的不同，均能找到適合自己材料的各儀器參數，達到了上機實訓的目的。

3.結語

綜上所述，通過課前制定科學詳細的課程規劃，這種“突出應用，簡化原理，立足平臺儀器”的理論體系和具有專業及實際特色的上機實訓體系，使掃描電鏡課程深受學生的歡迎，收到了良好的效果，同時也最大程度地發揮了現有儀器的資源優勢和師資特長。

在以后的課程中，我們將對生命科學各種材料的制樣方法分階段進行更高層次的探索，從而簡化制樣步驟和創建新的制樣方法，為獲取優質掃描電鏡圖像提供最基本的保證，為本院研究生的科研競爭力提供更優秀的技術平臺。

參考文獻：

[1]章曉中. 電子顯微分析[M]. 北京：清華大學出版社，2006. [2]徐柏森，馮汀，劉剛. 掃描電鏡生物樣品的快速制備方法研究，中國野生植物資源，2000，19（6）：47-49.

[3]豐島良太等。第五回醫學生物學走查電顯シソボジウム記錄1976： 17.