馬尾松水通道蛋白PmPIP1基因克隆及在干旱脅迫下的表達分析

蔡　瓊，丁貴杰，文曉鵬（1.貴州省森林資源與環境研究中心，貴州貴陽550025; 2.貴州大學林學院，貴州貴陽550025; .貴州大學貴州省農業生物工程重點實驗室,貴州貴陽550025）

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馬尾松水通道蛋白PmPIP1基因克隆及在干旱脅迫下的表達分析

蔡瓊1,2，丁貴杰1,2，文曉鵬3
（1.貴州省森林資源與環境研究中心，貴州貴陽550025; 2.貴州大學林學院，貴州貴陽550025; 3.貴州大學貴州省農業生物工程重點實驗室,貴州貴陽550025）

摘要：克隆馬尾松Pinus massoniana水通道蛋白（AQP），并對其生物信息學與干旱脅迫表達模式進行分析。采用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）以及互補脫氧核糖核酸（cDNA）末端快速擴增（RACE）方法克隆馬尾松水通道蛋白基因。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析其在干旱脅迫下的響應模式。結果克隆到一個馬尾松水通道蛋白基因，命名為PmPIP1（GenBank登錄號為KF582038）。此基因cDNA全長序列為1 301 bp，包括867 bp的完整開放閱讀框，99 bp的5′末端非翻譯區和335 bp的3′末端非翻譯區。編碼288個氨基酸殘基，分子量為30.86 kD，等電點（pI）8.48。PmPIP1與菠菜Spinacia oleracea（2b5fA）水通道蛋白結構相似。PmPIP1含有6個跨膜區，具有膜內在蛋白（MIP）家族信號序列、高等植物高度保守序列HINPAVTFG和2個天門冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（NPA）保守肽段。PmPIP1基因屬質膜內在蛋白（PIPs）亞族，與挪威云杉Picea abies水通道蛋白基因親緣關系最近，同源性達95%。qRT-PCR表明PmPIP1受干旱脅迫誘導表達。馬尾松PmPIP1的克隆豐富了植物AQP基因的資料庫，同時推測PmPIP1基因可能參與了馬尾松干旱脅迫過程。圖8表1參39

關鍵詞：植物學；馬尾松；水通道蛋白；克隆；表達

水通道蛋白（AQP）是指細胞膜上能選擇性地高效轉運水分子的膜轉運蛋白［1］。自1993年Maurel等［2］從擬南芥Arabidopsis thaliana中分離到第1個植物水孔蛋白γ-TIP以來，已在細菌、古生菌、真菌、動物和植物等幾乎所有生物中發現AQP［3-5］。在植物中，擬南芥［6］和水稻Oryza sativa［7-8］等AQP基因的研究較為清楚。根據水通道蛋白的亞細胞定位，結合序列同源性分為4種類型：質膜內在蛋白（PIP），液泡膜內在蛋白（TIP），類結瘤蛋白（NIP）及小堿性膜內蛋白（SIP）［9-10］。AQP屬跨膜通道的膜內在蛋白（MIP）家族，具有轉運水、甘油、小分子溶質的功能，在植物應對水分不足的響應機制中起著重要作用［11］。馬尾松Pinus massoniana因適生能力強、速生、豐產、綜合利用程度高等優良特性，成為中國南方最主要用材樹種之一［12］。以往關于馬尾松林的研究主要集中在林木栽培技術［13］、栽培機制［14-15］、連栽生態系統變化［16］、合理采伐年齡［17］、人工林生長規律［18］等方面，而對其分子生物學相關研究甚少［19］。干旱是影響林木正常生長發育的一個最重要的逆境因子。克隆馬尾松抗旱相關基因以及研究其表達調控，對揭示馬尾松抗旱分子機制具有十分重要的意義。其中，水通道蛋白PIPs亞型基因在植物干旱分子調控機制中是一個重要的調控基因，其不僅受脅迫表達變化，而且轉運活性受磷酸化調控［20］，參與非生物脅迫的響應。CUI等［21］發現過表達VfPIP1的擬南芥增強了植株的抗旱能力。ZHOU等［22］研究表明小麥Triticum aestivum TaAQP7（PIP2）在聚乙二醇（PEG）處理后表達量上調，在番茄Solanum lycopersicum中過量表達同樣增強了其抗旱性。目前，馬尾松水通道蛋白PIPs基因克隆和功能分析至今未見研究報道。因此，對馬尾松水通道蛋白PIPs基因進行克隆并分析其在干旱脅迫下的響應模式，為馬尾松抗旱基因工程和遺傳改良提供可資利用的基因資源。

1　材料與方法

1.1試驗材料

選用高抗旱馬尾松優良家系1年生幼苗為供試材料。植株平均高度為17.2 cm。培養容器為塑料盆（27 cm×18 cm×25 cm），按V（黃壤）∶V（河砂）=9∶2混合構成。設對照（土壤相對含水量為70%±5%）和中度脅迫（土壤相對含水量為40%±5%）2個處理。每天通過稱量法維持土壤相對含水量在試驗設計的范圍內。干旱脅迫實施0，3，5，10，15，20，25 d分根、莖、葉取試材，迅速徹底去除細土和其他雜物，液氮冷凍，保存于-80℃，作為實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）的試驗材料。

1.2方法

1.2.1總核糖核酸（RNA）的提取參照Plant RNA Reagent與RNAprep pure Plant Kit說明書進行。

1.2.2目的基因克隆根據美國生物技術信息中心（NCBI）數據庫中已報道的AQP基因序列，設計簡并引物M1與M2（表1），獲得PmPIP1基因中間片段。聚合酶鏈式反應（PCR）反應體系（25.0 μL）：模板1.0 μL，引物各1.0 μL，MasterMix 12.5 μL，重蒸水9.5 μL。PCR反應條件：預變性94℃3 min，變性94℃30 s，退火48.7℃30 s，延伸72℃1 min，35個循環，后延伸72℃10 min。在此片段基礎上，設計5′-RACE特異性引物GSP1，GSP2和GSP3（表1），參照5′-RACE system for rapid amplification of cDNA ends說明，擴增目的基因5′端序列。設計3′-RACE特異性引物M3與M4（表1），參照3′-FullRACE core set with prime ScriptTMRTase說明，擴增目的基因3′端序列。設計特異性引物M5與M6（表1），驗證PmPIP1基因互補脫氧核糖核酸（cDNA）全長序列。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下相應條帶，按照DNA Purification Kit試劑盒說明進行膠回收，與pMD18-T Vector連接，轉化大腸埃希菌Escherichia coli DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆子，送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。

表1　PmPIP1基因克隆及表達使用的引物Table 1 PCR primers used to the cloning and expression of PmPIP1

1.2.3序列分析測序結果采用DNAStar進行拼接，并與美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫進行局部序列比對基本檢索工具（BLAST）比對，利用ProtScale Sever軟件分析蛋白親水/疏水性；利用Ex-PASy ProtParam tool計算蛋白的等電點和分子量；利用TMHMM預測跨膜區；利用Signal P預測信號肽；利用SWISS-MODEL預測三級結構；利用DNAMAN軟件進行蛋白質序列的多重比對并構建基因的系統進化樹。

1.2.4基因表達分析設計特異引物M7和M8（表1）作為RT-qPCR引物，馬尾松18S和泛素（UBC）（表1）基因為內標基因，進行RT-qPCR反應，重復3次·反應-1。PCR反應體系為2×熒光定量預混試劑增強版（super real premix plus）10.0 μL，正、反向引物各為0.6 μL，cDNA模板0.5 μL，重蒸水8.3 μL，終體積20.0 μL。擴增程序95℃1 min，95℃10 s，60℃32 s，共35個循環。基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCT法［23］。采用SPSS16.0軟件進行數據統計分析，用方差分析（ANOVA）模塊分析差異顯著性。

2　結果與分析

2.1馬尾松PmPIP1基因cDNA全長的克隆

以cDNA為模板，用簡并引物進行PCR擴增,獲得1個458 bp的中間片段（圖1A）。在此基礎上，進行5′端與3′端PCR擴增。結果顯示：5′-RACE在520 bp左右獲得1條亮帶（圖1B）, 3′-RACE在460 bp左右獲得1條亮帶（圖1C）。PCR產物經回收、連接、轉化、測序及拼接，獲得PmPIP1基因序列。為驗證PmPIP1序列準確性，進行基因全長PCR擴增，在867 bp左右獲得1條亮帶,大小與拼接得到的PmPIP1基因的完整開放閱讀框大小一致（圖1D）。陽性克隆經測序證實擴增序列與拼接結果一致。此基因已登錄GenBank，登錄號為KF582038。對PmPIP1基因全長序列分析表明：全長cDNA為1 301 bp，含1個完整開放閱讀框867 bp，5′末端非翻譯區99 bp，3′末端非翻譯區335 bp，在100 bp處發現起始密碼子ATG，964 bp處發現終止密碼子TAG，編碼288個氨基酸（圖2）。利用NCBI的BLAST對PmPIP1進行蛋白保守區預測（圖3），結果顯示：PmPIP1有1個MIP保守區。PmPIP1的氨基酸殘基在MIP匹配區內與MIP蛋白保守區序列完全一致，可以推測PmPIP1基因是水通道蛋白基因家族一員。

圖1　瓊脂糖凝膠電泳結果Figure 1 Agarose gel electrophoresis results

圖2　PmPIP1基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列Figure 2 Nucleotide sequence and amino acid sequence of the PmPIP1 gene

圖3　PmPIP1核酸序列的保守結構域Figure 3 Conserved domains of nucleic acid sequences of PmPIP1

2.2生物信息學分析

ProtParam分析表明PmPIP1蛋白分子量為30.86 kD，理論等電點為8.48。此蛋白中相對含量比較多的氨基酸是甘氨酸Gly（G）和丙氨酸Ala（A），分別為36和34個；蛋白質不穩定指數為30.91，屬于穩定蛋白。經Signal P分析，沒有信號肽切割位點，說明此蛋白為非分泌蛋白。ProtScale表明此轉運蛋白符合膜蛋白的特征，具有較強的疏水性。Predictprotein顯示PmPIP1蛋白含有1個依賴于cAMP and cGMP蛋白激酶磷酸化位點、2個蛋白激酶C磷酸化位點、3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和10個肉豆蔻酰化位點。蛋白激酶C在許多信號通路中的功能與膜結合密切相關，N-豆蔻酰化一般被認為是一個組成性的過程和一個永久性的修飾，起開關作用［24］。這些位點可能與PmPIP1調控關系密切。

運用TMHMM Server軟件對PmPIP1進行跨膜區分析，膜螺旋中氨基酸期望值高達127.431 43，且具有水通道蛋白典型的6個跨膜區（TM1～TM6），由膜兩側的5個親水環（Loop A，B，C，D，E）連接，A，C和E環在細胞膜外，B，D環及N，C末端都位于細胞膜內（圖4）。TM2和TM3之間，TM5與TM6之間，各包含有1個天門冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸Asn-Pro-Ala（NPA）保守結構域，NPA高度保守，幾乎所有的MIP均具有此結構域。PmPIP1具有質膜水通道蛋白C環和E環的特征序列（GGGANXXXXGY 和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN）以及水通道形成有關的高度保守的EXXXTXXF/L單元，這與已經證明具有水通道蛋白功能的AtPIP1功能區的氨基酸序列高度一致。N末端53個氨基酸, C末端9個氨基酸，符合植物水通道蛋白PIPl亞家族成員的N-端長、C-端短的特點，因此，推測PmPIP1基因屬于PIP1亞家族成員。

圖4　PmPIP1蛋白跨膜區的預測Figure 4 Prediction model for transmenbrane domain of PmPIP1 protein

將PmPIP1與己知的其他植物水通道蛋白進行氨基酸序列多重比對分析，結果表明：PmPIP1與挪威云杉Picea abies具有極高的同源性，可達95%，與擬南芥，葡萄Vitis vinifera，陸地棉Gossypium hirsutum，無梗花櫟Quercus petraea，野茶樹Camellia sinensis，小果野芭蕉Musa acuminata，煙草Nicotiana tabacum，白花檉柳Tamarix albiflonum等植物的同源性達83%～87%（圖5）。由此可以看出：水通道蛋白基因家族編碼蛋白氨基酸序列的保守性非常強，不同植物的水通道蛋白序列具有高度的同源性。

圖5　PmPIP1氨基酸序列與其他植物AQP基因的氨基酸序列多重比對Figure 5 Multi-comparison in amino acid sequence of AQP gene between Pinus massoniana and other plant species

將PmPIP1氨基酸序列與其他植物AQP基因進行系統進化樹分析（圖6）。結果表明：PmPIP1與挪威云杉親緣關系最近，而且明顯可以看出PmPIP1與PIPs蛋白聚為一類，與NIPs，TIPs，SIPs蛋白等進化距離較遠（圖6）。因而推測PmPIP1在PIPs蛋白進化上是保守的。

圖6　PmPIP1蛋白的系統進化分析Figure 6 Phylogenetic analysis of PmPIP1 and other plant species

經SWISS-MODEL模型，采用自動搜索模式對PmPIP1氨基酸三級結構進行預測。結果顯示：模型殘基從44～278 bp，三級結構預測的模板是菠菜Spinacia oleracea（2b5fA），序列同源性77.872%。經Rasmol查看，發現兩者的結構十分相似（圖7）。

圖7　PmPIP1蛋白三維結構預測與菠菜AQP （2b5fA）蛋白三維結構預測Figure 7　The 3-dimensional prediction of the PmPIP1 and the spinach aquaporin（2b5fA）

2.3PmPIP1基因在馬尾松各組織中的表達及干旱脅迫下的表達分析

分別以馬尾松根、莖和葉cDNA為模板，進行PmPIP1基因的RT-PCR反應，18S作為內參基因，結果如圖8A所示。PmPIP1在根、莖、葉中均有表達，根中表達量最高，其次是莖和葉。為明確干旱脅迫對PmPIP1基因表達的影響，使用qRT-PCR技術研究馬尾松根、莖和葉表達模式。在干旱脅迫下，以18S為內參分析（圖8B），PmPIP1基因在根、莖中表達水平基本逐步升高，且在第10天表達程度最為強烈，而后開始降低；葉中表達量差異不大。以UBC為內參分析（圖8C），在根、莖、葉中表達水平趨勢基本與以18S為內參的結果基本一致。上述結果暗示，PmPIP1基因的表達與干旱脅迫相關。

圖8　PmPIP1基因的相對表達量分析Figure 8 Analysis of relative expression level of PmPIP1

3　討論

馬尾松是荒山造林的先鋒樹種，同時也是一種非常重要的耐旱樹種，可能蘊含著豐富的抗逆基因資源。為了在分子水平上深入研究馬尾松抗旱分子機制，本研究對馬尾松重要的耐旱相關基因-水通道蛋白基因開展了研究。

通過RT-PCR及表達序列標簽（EST）序列拼接，獲得PmPIP1基因，該基因具有MIP家族典型的保守氨基酸序列HINPAVTFG，2個NPA保守肽段，6個跨膜結構域，較長的N端和較短的C端，說明該蛋白屬于水通道蛋白基因家族一員。聚類分析表明：PmPIP1與挪威云杉同源關系達95%，與其他8種植物AQP基因同源性達83%～87%。將PmPIP1與其他植物AQP基因構建系統進化樹分析，進一步推測PmPIP1屬于質膜水通道蛋白PIPs亞家族，與挪威云杉親緣遺傳距離最近。三級結構預測表明：PmPIP1與已登陸的菠菜（2b5fA）AQP三級結構極為相似。大量研究已表明，AQP是調節水分在細胞間以及植物整個體內水分平衡分子基礎［25］，其中大約70%～90%的水分受到水通道蛋白基因的表達調控［26］。PmPIP1基因與AQP基因的相同保守性以及基本結構的相吻合意味著PmPIP1在功能上可能具有與其他物種非常相近的作用模式［27-28］。

植物AQP的轉運活性受磷酸化調控，是細胞信號轉導與水分運輸調節的媒介，磷酸化時水通道蛋白水運轉活性增加，直接就近參與原位的快速、直接、可逆的門控［20,25］,促進上調水通道的活性［29］。PmPIP1蛋白包括5個色氨酸（Ser），2個蘇氨酸（Thr）和2個酪氨酸（Tyr）。這些位點可能成為蛋白激酶磷酸化位點，直接或間接參與PmPIP1對水分或其他物質運輸的調節。

在研究植物抗旱分子機制的過程中，從干旱誘導的基因中已分離出很多水通道蛋白基因［30-31］。AQP蛋白受環境條件和植物激素的調節，有些組成型表達，有些特異性表達，參與根葉生長、有性繁殖及非生物脅迫等過程［32-34］，表達方式也存在顯著差異［35］。Marc等［36］研究表明, PIP1和PIP2基因在生殖器官中的表達水平不同，PIP1 RNA在柱頭累積, PIP1和PIP2 RNA在花粉囊的幾乎所有組織中多有表達。JcPIP在植株的整個生長發育期都有表達，在干旱脅迫下表達量增加［32］。PIP2在木欖樹Bruguiera gymnorhiza根中表達量明顯強于嫩莖和葉［37］。本研究發現PmPIP1基因在馬尾松的根、莖、葉中均有表達,根中表達量最高，莖次之，葉最低。水通道蛋白在不同組織中的含量不同，并隨細胞生理狀態和環境與刺激產生波動［38］。PmPIP1基因在干旱脅迫不同時期的表達特性分析顯示，PmPIP1在根、莖中表達水平首先呈上升趨勢，表明干旱初期隨著時間延長，PmPIP1受到水分虧缺的誘導，表達量增加，到第10天表達量達到最高值，隨后由于PmPIP1無法再適應干旱的加劇，于是呈現下降趨勢；葉中表達量差異不大。推測PmPIP1基因的這種表達模式可能與植物在干旱脅迫下首先由根系從土壤中吸收水分，再經木質部導管向上運輸最后由葉片蒸騰散失的生理現象相關。

XU等［39］分離到MaPIP1;1基因，并且在擬南芥中過表達MaPIP1;1增強了轉基因植株的耐鹽和滲透脅迫能力。因此將PmPIP1轉入模式植物（擬南芥、煙草等）并驗證是否能提高轉基因植株抗旱能力需要進一步驗證。本實驗室目前正在進行轉基因研究，以期為該基因在植物中的進一步利用奠定基礎。

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Cloning of the PmPIP1 gene from Pinus massoniana and its expression with drought stress

CAI Qiong1,2, DING Guijie1,2, WEN Xiaopeng3
（1.Institute of Forest Resources and Environment, Guiyang 550025, Guizhou, China; 2.College of Forestry, Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China; 3.Guizhou Key Laboratory of Agricultural Bioengineering, Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China）

Abstract:The aquaporin（AQP）gene plays an important role in plants adapting to abiotic stresses.To predict the AQP gene function and provide basal data for mechanism of Pinus massoniana’s drought resistance, the sequence characteristics of the AQP gene from P.massoniana were analyzed and its expression profiling was studied after drought-stress treatment.The AQP gene was cloned using reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）and rapid-amplification of complementary deoxyribonucleic acid（cDNA）ends（RACE）.The expression of the AQP gene was then performed using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction（qRT-PCR）.The full-length cDNA of the AQP gene from P.massoniana, designated PmPIP1 with a registered number in GenBank KF582038, was obtained.Results of the sequence analysis showed that the sizebook=192,ebook=13of PmPIP1 was 1 301 bp, containing an 867 bp open reading frame that encoded 288 amino acid residues with 30.86 kDa molecular weight and an 8.48 isoelectric point, a 99 bp 5′terminal untranslated regions（UTR）, and a 335 bp 3′terminal UTR.The PmPIP1 3D structure had a strong similarity to Spinacia oleracea（2b5fA）.PmPIP1 exhibited a typical structure with six transmembrane domains, and had the consensus sequence HINPAVTFG of membrane intrinsic protein（MIP）family and two highly conserved peptides Asn-Pro-Ala（NPA）.The evolutionary analysis revealed that PmPIP1 shared a 95% identity with Picea abies and belonged to PIPs.The PmPIP1 expression patterns with drought conditions showed that drought did induce PmPIP1.In conclusion, cloning of the PmPIP1 gene from P.massoniana enriched the plant aquaporin gene database, and the qRT-PCR analysis indicated that the PmPIP1 gene may be involved in the response related to drought stress.［Ch, 8 fig.1 tab.39 ref.］

Key words:botany; Pinus massoniana; aquaporin; cloning; expression

作者簡介：蔡瓊，從事林木栽培生理生態與分子生物學研究。E-mail：dukecq@sina.com。通信作者：丁貴杰，教授，博士生導師，從事森林培育和人工林穩定性等研究。E-mail：gjdinggzu@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31260183）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAD09B0102）；國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）項目（2011AA10020301）；貴州省重大專項（黔科合重大專項字［2012］6001號）；貴州省人才基地建設項目（黔人領發［2009］9號）

收稿日期：2015-04-10；修回日期：2015-05-18

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.002

中圖分類號：S791.248

文獻標志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）02-0191-10