禾谷鐮刀菌甾醇14α脫甲基酶基因cDNA克隆及生物信息學分析

孫曉梅+黃金光

摘要： 克隆獲得禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）2個甾醇14α脫甲基酶CYP51蛋白（CYP51A、CYP51B）基因cDNA序列，明確其氨基酸序列典型特征，為研究蛋白質結構及其抗藥性機制奠定基礎。采用RT-PCR技術，克隆2個CYP51蛋白基因cDNA序列，利用相關生物信息軟件對其序列進行生物信息學分析。結果克隆到2條cDNA序列，長度分別為1 524、1 581 bp，分別編碼507、526個氨基酸；2個蛋白分子量分別為57.5、59.3 ku，等電點分別為693、7.08，不穩定系數分別為49.43、39.05；2個蛋白均含有細胞色素P450家族成員典型的保守結構域；不具有信號肽的屬于非分泌性蛋白，具有跨膜結構域，是親水性蛋白；蛋白質二級結構最主要的結構元件是α螺旋、無規則卷曲，并散布于整個蛋白中；亞細胞定位預測顯示，CYP51A蛋白主要位于內質網及高爾基體等細胞器中，而CYP51B主要位于細胞質中。研究結果將為進一步研究CYP51蛋白生物學功能及其蛋白結構生物學提供參考。

關鍵詞： 禾谷鐮刀菌；甾醇14α脫甲基酶；基因克隆；抗藥性；生物信息學分析；cDNA

中圖分類號： S182；Q785 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0031-05

小麥赤霉病（fusarium head blight，FHB）是我國小麥生產中最主要的病害之一，由鐮刀菌屬（Fusarium spp.）多種真菌引起[1]。在全世界范圍內，禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是小麥赤霉病主要的病原菌，在2012年Molecular Plant Pathology上發表的十大病原真菌中，由于其發生的普遍性和重要性，居于第4位[2]。使用殺菌劑是控制赤霉病發生和危害的主要手段，通常用于防治小麥赤霉病的殺菌劑為苯并咪唑類殺菌劑多菌靈[3]。但是長期、單一、大量使用，使其產生了嚴重的抗藥性，造成防效顯著下降。因此，明確禾谷鐮刀菌對唑類殺菌劑產生抗性機制具有重要的理論、生產實踐價值。殺菌劑作用于甾醇生物合成中的14α脫甲基酶（CYP51），CYP51屬于細胞色素P450（Cytochrome P450，簡稱CYP）家族第5類中唯一的一個家族，與P450其他家族相比，CYP51功能非常保守，作用于移除甾醇前體14α位的甲基，又稱為甾醇14α脫甲基酶，催化酵母、真菌羊毛甾醇或齒孔醇，植物鈍葉醇和哺乳動物二氫羊毛甾醇的14α位脫甲基反應，具有較強的底物特異性[4-6]。病原真菌中含有多個CYP51基因，對唑類藥劑產生抗性的病原菌中，CYP51基因點突變是病原菌對唑類殺菌劑產生抗性的主要機制[7-9]。由于唑類殺菌劑中均含有1個含氮雜環，雜環上的氮原子可以與CYP51蛋白血紅素-鐵活性中心以配位鍵結合，競爭底物的結合位點，使酶的活性受到抑制。當唑類殺菌劑結合區域的氨基酸位點發生突變后，使藥劑與CYP51蛋白的結合能力下降，引起病原菌的抗藥性。在人類病原菌白色念珠菌（Candida albicans）點突變研究中已經證實了上述假設，如F145L[10]、Y132H、R467K[11]等突變。迄今為止，CYP51突變引起抗藥性報道最多的真菌是C. albicans，其引起抗性的突變位點多達50個。對已報道的突變位點的位置進行分析，大部分突變位點集中在2個區域，分別為CYP51蛋白的N端、C端，這可能與蛋白折疊后的二級結構、三級結構中底物和藥劑的結合位點有關[12]。CYP51蛋白N端包括α螺旋B、B′、C及其中間的Loop連接部分，在這個區域的點突變中，尤其以位于α螺旋B′和C之間的1個酪氨酸突變引起的抗性報道最多，包括C. albicans中CYP51的Y132F位點突變[13]，以及其他真菌斐濟球腔菌（Mycosphaerella fijiensis）、白粉病菌（Blumeria graminis f. sp.）中的Y136F[14-15]，禾生球腔菌（Mycosphaerella graminicola）中的Y137F[16]，以及葉銹菌（Puccinia triticina）中的Y134F位點突變等[17]。M. graminicola中的Y137F突變使三唑醇不能夠再與酶結合，引起抗性的發生[18]。第2個突變區域為 CaCYP51 蛋白氨基酸序列的428～459位或MgCYP51蛋白氨基酸序列的438～463位[19]。MgCYP51中保守位點Y459、G460及Y461的突變或/和缺失都能夠引起唑類殺菌劑敏感性下降[20]。可見，CYP51蛋白氨基酸突變使病原菌對藥劑產生抗藥性。CYP51功能非常保守，但是不同生物中CYP51氨基酸序列的同源性不高，生物界之間其氨基酸的相似性只有 22%～30%；而同一生物界中，其氨基酸序列的同源性較高，在動物、植物、真菌中CYP51的相似性分別為64%、41%、42%[21]。禾谷鐮刀菌含有3個CYP51基因FGCYP51A、FGCYP51B、FGCYP51C，這3個基因雖然序列同源性較高，卻發揮著不同的功能。Fan等對這3個基因的功能進行了遺傳學研究，發現FGCYP51A與FGCYP51B編碼甾醇14α脫甲基酶，與病原菌對唑類殺菌劑的敏感性密切相關[22]。

目前，病原真菌中CYP51蛋白三維結構未見報道，且有關CYP51抗藥性機制研究集中在基因遺傳突變研究。因此，有必要從CYP51的蛋白結構入手研究其抗藥性機制。解析蛋白質結構首先要對蛋白質進行分析，構建包含主要功能域的表達載體，進而體外純化出高質量的目標蛋白，為后續生物學功能及生化功能試驗奠定基礎。本研究采用RT-PCR技術，克隆2個CYP51蛋白基因cDNA序列，利用生物信息學方法，對禾谷鐮刀菌FGCYP51A、FGCYP51B基因編碼的蛋白質進行分析，包括氨基酸組成、預測保守結構域、信號肽及跨膜結構域及亞細胞定位等，以期為進一步研究CYP51蛋白晶體結構及其生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 本試驗菌種為禾谷鐮刀菌（F. graminearum）PH-1[23]。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑（Trizol Reagent）、總反轉錄酶（M-MLV）、DNase，購自Promega公司；PCR克隆試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit、SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit、質粒提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit）、Taq酶、pMD18-T，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取和RT-PCR 收集禾谷鐮刀菌菌絲體，抽干后置于液氮中速凍并轉移，于-80 ℃備用。從液氮中取出冷凍抽干的菌絲約100 mg，置于預冷的研缽中，磨成粉末，并迅加入1 mL Trizol。總RNA抽提步驟按Trizol Reagent說明書進行，所提取的總RNA用2%的瓊脂糖電泳檢驗其分子的完整情況，并用分光光度法檢測其濃度。以Oligo（dT）18為引物、1 μg總RNA為模板，按照反轉錄試劑盒SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit操作說明書合成第1鏈 cDNA。通過國際禾谷鐮刀菌網站（http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_graminearum/MultiHome.html）查找CYP51蛋白2個基因，分別為FGCYP51A、FGCYP51B，根據此序列設計引物（表1），并通過 PCR 克隆2個基因的cDNA片段（圖1）。引物序列由上海英駿生物技術有限公司合成。PCR 擴增條件均為：94 ℃預變性3 min；94 ℃30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖電泳檢測后，回收目的片段，純化后克隆至載體pMD18-T，轉化感受態細胞E. coli JM109。所篩選的陽性克隆經檢測后由上海英駿生物技術有限公司進行測序。

1.2.2 分析方法 利用在線軟件protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析CYP51蛋白氨基酸序列[24]；用NCBI網站在線軟件Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測保守結構域[25]；用在線軟件NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析磷酸化位點；用protscale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析氨基酸序列的疏水性/親水性；利用PSORT Ⅱ（http：//psort.hgc.jp/form2.html）進行亞細胞定位的預測；利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預 測 信 號肽；利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測跨膜結構域；利用在線軟件sopma（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）預測二維結構。

2 結果與分析

2.1 cDNA的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法獲得FGCYP51A、FGCYP51B 2個基因，其cDNA序列全長分別為1 524、1 581 bp（圖1）。推測其蛋白質分別有507、526個氨基酸殘基，通過在線軟件 protparam 對禾谷鐮刀菌CYP51蛋白理化性質進行分析，CYP51A蛋白的分子式為C2606H4053N697O736S19，總計由8 111個原子組成，分子量約為57 533.2 u，等電點為6.93，不穩定系數為49.43（40以下為穩定蛋白），推測其為不穩定蛋白。該蛋白中亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸、脯氨酸、絲氨酸等含量相對較多，而半胱氨酸、色氨酸含量相對較少（圖2-A）。CYP51B蛋白的分子式為 C2680H4144N720O754S23，總計由8 321個原子組成，分子量約為 59 252.1 u，等電點為7.08，不穩定系數為39.05（40以下為穩定蛋白），推測其為穩定蛋白。該蛋白中丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、絲氨酸等含量相對較多，而半胱氨酸、色氨酸含量相對較少（圖2-B）。

2.2 CYP51蛋白保守結構域分析

利用Conserved Domains程序對CYP51蛋白進行結構域分析，從圖3可以看出，CYP51A蛋白第36～499位氨基酸和CYP51B蛋白第72～525位氨基酸分別組成了細胞色素P450家族成員典型的保守結構域。

2.3 CYP51蛋白氨基酸序列翻譯后的磷酸化修飾

預測細胞內蛋白質磷酸化在信號轉導中發揮著重要的作用，研究報道共有3種主要的磷酸化部位——絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸結合位點。大多數蛋白質是在絲氨酸、蘇氨酸殘基上磷酸化，而許多與信號轉導有關的蛋白質還在酪氨酸位置上被磷酸化。利用在線軟件NetPhos分析可看出，在CYP51A中含有11個絲氨酸磷酸化位點，9個蘇氨酸磷酸化位點，13個酪氨酸磷酸化位點（圖4-A）；在CYP51B中含有14個絲氨酸磷酸化位點，3個蘇氨酸磷酸化位點，9個酪氨酸磷酸化位點（圖4-B）。CYP51蛋白磷酸化后，改變蛋白質的活性，這種改變可能為激活，也可能是抑制作用。

2.4 CYP51蛋白二級結構預測

多肽鏈借助氫鍵排列成沿一維方向而呈現有規則的重復構象的二級結構，是氨基酸順序與三維構象之間的橋梁。二級結構借助范德華力、氫鍵、靜電和疏水等相互作用形成蛋白質的三級結構，從而發揮正常的生物學功能。利用SOPMA軟件對CYP51蛋白的氨基酸序列的二維結構進行預測，由圖5可知，CYP51A、CYP51B均含有α螺旋、無規則卷曲、β折疊延伸鏈、β轉角結構，其中α螺旋結構部分較多，分別占37.08%、4125%，其次為無規則卷曲，分別占36.09%、36.50%，β折疊片層結構分別占19.13%、15.40%，最少的是β轉角，分別占7.69%、6.84%。可見α螺旋、無規卷曲是CYP51A、CYP51B的最主要二級結構，分布于整條肽鏈中。

2.5 CYP51蛋白的信號肽和跨膜結構域分析

利用相關軟件對CYP51蛋白的信號肽和跨膜域進行預測，由圖6-A可知，CYP51A的C值最大切割點在第22個氨基酸位置，分值為0.392，綜合剪切點分值（Y值）最高也在第22個氨基酸位置，為0.412，信號肽最大分值（S值）在第2個氨基酸位置，為0.666，因此判斷CYP51A沒有信號肽，屬于非分泌性蛋白。CYP51B的C值最大切割點在第16個氨基酸位置，分值為0.111，綜合剪切點分值（Y值）最高在第25個氨基酸位置，為0.131，信號肽最大分值（S值）在第19個氨基酸位置，為0.202，因此判斷CYP51B沒有信號肽（圖6-B），屬于非分泌性蛋白。由圖6-C可知，CYP51A蛋白30～507位氨基酸在膜外，1～6位氨基酸在膜內，7～29位氨基酸（YPLWVLVALFAVIIANLLYQQLP）組成跨膜結構域。CYP51B蛋白有2個跨膜結構域，分別為20～42位氨基酸（PLGQQVGIGFAVFLVLSVVLNVL）、55～77位氨基酸（MVFHWFPFVGSTITYGMDPPTFF），1～19、78～526位氨基酸在膜外，43～54位氨基酸在膜內（圖6-D）。

2.6 CYP51蛋白氨基酸序列疏水性/親水性分析

蛋白質結構的特征是疏水/親水間的平衡，了解氨基酸序列疏水性/親水性對蛋白質的結構和功能預測有一定的作用。用protscale分析CYP51蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性，根據氨基酸分值越高疏水性越強、得分越低親水性越強的規律，從圖7-A可以看出CYP51A在30、60、230、250、410位氨基酸附近分別包含1個親水頭部，親水性區域超過疏水性區域，屬于親水性蛋白。可以看出CYP51B在80、170、250、270、420、440位氨基酸附近分別包含1個親水頭部，親水性區域超過疏水性區域，也屬于親水性蛋白（圖7-B）。

2.7 CYP51蛋白的亞細胞定位預測

了解蛋白的亞細胞定位可為蛋白功能預測提供基礎。利用在線軟件PSORT Ⅱ對CYP51蛋白的亞細胞定位進行預測，結果表明，CYP51A蛋白分布在內質網概率為55.6%，高爾基體為33.3%，細胞質膜為11.1%。CYP51B蛋白分布在細胞質中概率為39.1%，細胞核及線粒體均為17.4%，內質網為13.0%，囊泡分泌系統、高爾基體及過氧化物酶體均占4.3%。

3 討論與結論

CYP51被認為是細胞色素P450超級家族中最古老的家族，存在于幾乎所有的生物中，包括動物、植物、酵母、真菌等真核生物以及原生動物和細菌等原核生物，因此推測其在主要的真核生物族群分化之前就已經形成[26-27]。雖然CYP51的功能非常保守，但是不同生物中CYP51氨基酸序列的同源性并不相同。Lepesheva 等對180多個已知的CYP51氨基酸序列，包括原核、真核生物中的CYP51進行比對，結果發現在所有生物中都保守的氨基酸有15個，所有真核生物中都保守的氨基酸有24個[6]。此外，真菌 CYP51 中還含有1個真菌特異性 C端結構域，其中包括1段只在真菌中保守的序列 DF/YGF/YG[19]。因此，以病原真菌的CYP51為靶標而開發的殺真菌劑，對真菌具有特異性。

Becher等對38個子囊菌中的CYP51基因進行分析，其中18個種的真菌中含有1個CYP51基因，15種真菌中包括2個CYP51基因，其他5種真菌中含有3個CYP51基因，其中含有2個及以上CYP51基因的真菌數量在總數的50%以上[28]。真菌CYP51蛋白序列系統進化樹分析表明，CYP51分為3支，分別為CYP51A、CYP51B、CYP51C。在所有比對序列中，單一CYP51基因都聚類為CYP51B；而除鐮刀菌屬之外，含有2個以上CYP51基因的真菌，其CYP51基因聚類為CYP51A或者CYP51B。禾谷鐮刀菌（F. graminearum）含有3個CYP51基因FGCYP51A、FGCYP51B、FGCYP51C，它們分別編碼507、526、517個氨基酸，蛋白序列間的一致性為6165%。其中FGCYP51A、FGCYP51B基因編碼甾醇14α脫甲基酶，與禾谷鐮刀菌抗藥性產生有關。本研究對這2個蛋白進行了生物信息學分析，CYP51蛋白沒有信號肽，具有跨膜結構域，屬于親水性蛋白；二者具有細胞色素P450家族成員典型的保守結構域；具有多個絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化修飾位點，可能與其表達的生物學功能相適應；二級結構預測表明，CYP51蛋白以無規卷曲和α螺旋為主，推測與其活性位點形成有關。

本研究克隆了FGCYP51A、FGCYP51B基因的cDNA，為進一步構建蛋白表達載體進行蛋白表達純化，進而開展蛋白結構生物學研究。利用生物信息學方法預測了CYP51蛋白的理化性質、結構域和亞細胞定位等基本信息，這些結果也為構建不同長度及功能域的表達載體提供了線索，為后期蛋白純化提供了依據。

參考文獻：

[1]張洪濱，柳金偉，劉秉江，等. 山東省小麥赤霉病菌種群組成及其致病力分化[J]. 植物保護學報，2013，40（1）：27-32.

[2]Dean R，van Kan J A，Pretorius Z A，et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology[J]. Molecular Plant Pathology，2012，13（4）：414-430.

[3]龔雙軍，楊立軍，向禮波，等. 2013年湖北省小麥赤霉病菌對多菌靈和戊唑醇的敏感性[J]. 農藥學學報，2014，16（5）：610-613.

[4]Alcazar-Fuoli L，Mellado E，Garcia-Effron G，et al. Ergosterol biosynthesis pathway in Aspergillus fumigatus[J]. Steroids，2008，73（3）：339-347.

[5]Bean T P，Cools H J，Lucas J A，et al. Sterol content analysis suggests altered eburicol 14α-demethylase （CYP51） activity in isolates of Mycosphaerella graminicola adapted to azole fungicides[J]. FEMS Microbiol Lett，2009，296（2）：266-273.

[6]Lepesheva G I，Waterman M R. Sterol 14α-demethylase cytochrome P450（CYP51），a P450 in all biological kingdoms[J]. Biochim Biophys Acta，2007，1770（3）：467-477.

[7]Ghosoph J M，Schmidt L S，Margosan D A，et al. Imazalil resistance linked to a unique insertion sequence in the PdCYP51 promoter region of Penicillium digitatum[J]. Postharvest Biology and Technology，2007，44（1）：9-18.

[8]Mellado E，Garcia-Effron G，Alcázar-Fuoli L，et al. A new Aspergillus fumigatus resistance mechanism conferring in vitro cross-resistance to azole antifungals involves a combination of cyp51A alterations[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2007，51（6）：1897-1904.

[9]Snelders E，van der Lee H A L，Kuijpers J，et al. Emergence of azole resistance in Aspergillus fumigatus and spread of a single resistance mechanism[J]. PLoS Medicine，2008，5（11）：e219.

[10]Kudo M，Ohi M，Aoyama Y，et al. Effects of Y132H and F145L substitutions on the activity，azole resistance and spectral properties of Candida albicans sterol 14-demethylase P450 （CYP51）：a live example showing the selection of altered P450 through interaction with environmental compounds[J]. Journal of Biochemistry，2005，137（5）：625-632.

[11]Park H G，Lee I S，Chun Y J，et al. Heterologous expression and characterization of the sterol 14α-demethylase CYP51F1 from Candida albicans[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2011，509（1）：9-15.

[12]Becher R，Wirsel S G. Fungal cytochrome P450 sterol 14α-demethylase （CYP51） and azole resistance in plant and human pathogens[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2012，95（4）：825-840.

[13]Morio F，Loge C，Besse B，et al. Screening for amino acid substitutions in the Candida albicans Erg11 protein of azole-susceptible and azole-resistant clinical isolates：new substitutions and a review of the literature[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2010，66（4）：373-384.

[14]Caas-Gutiérrez G P，Angarita-Velásquez M J，Restrepo-Flórez J M，et al. Analysis of the CYP51 gene and encoded protein in propiconazole-resistant isolates of Mycosphaerella fijiensis[J]. Pest Management Science，2009，65（8）：892-899.

[15]Wyand R A，Brown J K. Sequence variation in the CYP51 gene of Blumeria graminis associated with resistance to sterol demethylase inhibiting fungicides[J]. Fungal Genetics and Biology，2005，42（8）：726-735.

[16]Leroux P，Walker A S. Multiple mechanisms account for resistance to sterol 14α-demethylation inhibitors in field isolates of Mycosphaerella graminicola[J]. Pest Management Science，2011，67（1）：44-59.

[17]Stammler G，Cordero J，Koch A，et al. Role of the Y134F mutation in cyp51 and overexpression of cyp51 in the sensitivity response of Puccinia triticina to epoxiconazole[J]. Crop Protection，2009，28（10）：891-897.

[18]Mullins J G L，Parker J E，Cools H J，et al. Molecular modelling of the emergence of azole resistance in Mycosphaerella graminicola[J]. PLoS One，2011，6（6）：e20973.

[19]Podust L M，Stojan JPoulos T L，Waterman M R. Substrate recognition sites in 14α-sterol demethylase from comparative analysis of amino acid sequences and X-ray structure of Mycobacterium tuberculosis CYP51[J]. J Inorg Biochem，2001，87（4）：227-235.

[20]Cools H J，Fraaije B A. Update on mechanisms of azole resistance in Mycosphaerella graminicola and implications for future control[J]. Pest Management Science，2013，69（2）：150-155.

[21]Lepesheva G I，Waterman M R. Structural basis for conservation in the CYP51 family[J]. Biochimica et Biophysica acta，2011，1814（1）：88-93.

[22]Fan J，Urban M，Parker J E，et al. Characterization of the sterol 14α-demethylases of Fusarium graminearum identifies a novel genus-specific CYP51 function[J]. The New Phytologist，2013，198（3）：821-835.

[23]Cuomo C A，Güldener U，Xu J R，et al. The fusarium graminearum genome reveals a Link between localized polymorphism and pathogen specialization[J]. Science，2007，317（5843）：1400-1402.

[24]Gasteiger E，Hoogland C，Gattiker A，et al. The proteomics protocols handbook[M]. Totowa，New Jersey：Humana Press，2005：571-607.

[25]Marchler-Bauer A，Lu S，Anderson J B，et al. CDD：a conserved domain database for the functional annotation of proteins[J]. Nucleic Acids Research，2011，39：D225-D229.

[26]Aoyama Y，Noshiro M，Gotoh O，et al. Sterol 14-demethylase P450 （P45014DM*） is one of the most ancient and conserved P450 species[J]. Journal of Biochemistry，1996，119（5）：926-933.

[27]Werck-Reichhart D，Feyereisen R. Cytochromes P450：a success story[J]. Genome Biology，2000，1（6）：1-9.

[28]Becher R，Weihmann F，Deising H B，et al. Development of a novel multiplex DNA microarray for Fusarium graminearum and analysis of azole fungicide responses[J]. BMC Genomics，2011，12（1）：52.