紅掌佛焰苞數字基因表達譜及關鍵基因表達水平分析

彭佳佳+劉克林+劉麗婭+呂學華+楊哲+李佩愉+劉春+明軍+袁素霞+平吉成+張黎

摘要： 以紅掌佛焰苞S5（盛花期：紅色）、S8（衰老期：綠色）時期為試驗材料進行數字基因表達譜（digital gene expression profiling，DGE）測序，分別得到12 766 374條（1.28 G）、18 583 390條（1.86 G）可分析序列（clean reads），被成功注釋有差異表達的基因序列2 316條。為探究紅掌佛焰苞顏色變化過程中關鍵基因的表達水平，將差異基因定位在花青素生物合成途徑11條表達量變化的序列上，并通過實時熒光定量PCR對其中的4條序列進行檢驗，驗證了DGE測序結果的準確性。同時研究這4個序列在紅掌佛焰苞生長過程中的表達水平，結果表明：在佛焰苞發育初期，3條序列相對表達量逐漸增高，1條在S2時期降低，但均在S3時期達到最高或較高值；在S4、S5、S6、S7、S8時期，隨著佛焰苞的成熟，4條序列表達量大體上均逐漸下降，在S8衰老期表達量最低。研究結果證明了這4條基因序列是紅掌佛焰苞花色形成中的關鍵基因，S3時期是花青素生物合成的高峰期。

關鍵詞： 數字基因表達譜；紅掌佛焰苞；花青素；基因表達水平；基因序列；關鍵基因；花色變化；關鍵酶

中圖分類號： S682.03 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0048-05

紅掌（Anthurium andraeanum）為天南星科花燭屬多年生常綠草本植物，原產于中美洲、南美洲熱帶地區[1]，以其花色豐富艷麗的心形佛焰苞片和持久的花期廣受消費者喜愛。花色是花卉重要的觀賞性狀，花色的形成主要是由不同類型花色素在花瓣中的積累決定的[2]。Iwata等研究表明，紅掌花青素主要有花色苷、花葵苷2種，并且花色與這2種色素苷的比例有關[3]。花青素在花瓣的生長發育過程中會發生一系列變化，其合成也受相關合成酶基因的轉錄水平所控制[4-6]。

數字基因表達譜（DGE）是利用新一代高通量測序技術對某物種的特定組織在特定狀態下基因的表達量變化情況進行檢測的結果，現已被廣泛應用于基礎科學研究、醫學研究和藥物研發等領。通過DGE可以篩選出有差異表達的基因序列信息，研究基因表達量的變化是調控細胞生命活動過程的核心機制[7]。

紅掌佛焰苞在生長發育過程中會由紅色逐漸變為綠色，這與其花青素生物代謝合成過程中關鍵基因的表達量存在一定的關系。本試驗通過對紅掌佛焰苞S5、S8時期進行DGE測序，得到在紅掌顏色變化過程中存在差異表達的基因序列，并選擇有關基因探究其在紅掌佛焰苞生長發育過程中的表達水平，為紅掌花色基因全長克隆、分子標記，及改良育種等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自北京大興苗圃2年生火焰（Dakota）2個生長期：S5（盛花期），佛焰苞全部展開，肉穗上部黃色，下部白色（此時為商品最佳觀賞期）；S8（衰老期），佛焰苞全部轉為綠色，肉穗變為深綠色（圖1）。采取健康佛焰苞于-80°C貯存備用。

1.2 試劑與儀器

總RNA提取采用植物RNA提取試劑盒Esayspin，購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉錄試劑盒：SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR，購自invetrogen公司；熒光定量試劑盒：FastStart Universal SYBR Green Master （ROX），購自Roche公司；Taq DNA聚合酶，由天根生化科技（北京）有限公司提供。試驗用到的主要儀器有PCR儀、ABI7900HT熒光定量PCR儀、臺式離心機、超低溫高速離心機、恒溫水浴鍋、制冰機、電泳儀、凝膠成像系統及超凈工作臺等。引物由深圳華大基因科技服務有限公司合成。試驗對紅掌的S5（盛花期：紅色）、S8（衰老期：綠色）進行的DGE測序，由北京諾禾致源科技有限公司完成。

1.3 植物總RNA提取

植物總RNA提取方法按照Esayspin試劑盒說明書進行，提取結果用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。條帶28 S ∶ 18 S亮度比約為2 ∶ 1，說明RNA無降解；用Biodrop超微量蛋白核酸分析儀測得D260 nm/280 nm在1.8～2.2之間，則說明RNA質量合格，可進行后續測序試驗。

1.4 紅掌佛焰苞DGE測序

樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用6堿基隨機引物（random hexamers）合成1鏈 cDNA；然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase I合成2鏈cDNA；隨后用AMPure XP beads試劑盒純化雙鏈cDNA。將純化的雙鏈cDNA進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進行片段大小選擇，最后進行PCR富集得到最終的cDNA文庫。測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司利用Illunima HiSeqTM2000/MiseqTM平臺完成。

1.5 DGE測序結果分析

測序得到原始測序序列（raw reads），為保證信息分析質量，必須對原始測序序列過濾去除里面含有帶接頭的、低質量的reads（質量值sQ≤5的堿基數占整個reads 50%以上的reads），得到clean reads（指過濾去除里面含有帶接頭的、低質量的reads后，可以進行后續分析的可用序列），后續分析基于clean reads進行。以紅掌轉錄組測序結果為參考序列，基因表達水平以RPKM（reads per kilo bases per million mapped reads）[8]為評估方法。以Audic等方法[9]對2個時期的樣本進行差異基因篩選，后續對樣本間差異基因功能上的基因本體論（gene ontology，GO）富集分析[10]和這些基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑的KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析[11]都基于差異基因。篩選出與紅掌佛焰苞顏色變化有關的差異基因，驗證DGE測序結果并探究這些差異基因在紅掌佛焰苞整個發育過程中的表達水平。

1.6 實時熒光定量PCR 驗證

根據測序結果得到紅掌佛焰苞顏色變化的關鍵差異基因序列，用Primer 5.0設計特異引物。分別提取紅掌佛焰苞S1至S8整個發育時期（圖1）的總RNA，反轉成cDNA進行熒光定量試驗，PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，55°C 60 s，72℃ 20 s，40個循環。用RQ manager 軟件進行CT值分析，用2-ΔΔCT法計算基因的表達水平。以S5（盛花期：紅色）作為對照時期、紅掌CYP（登陸號：JN602201，CYP-F：5′-TTCGACATGRMRRTCGGCGGC-3′；CYP-R：5′-CGACRTGCTTSCCRTCRAGCC-3′）作為內參基因[12]。

2 結果與分析

2.1 DGE測序結果分析

通過DGE測序，樣本S5、S8分別得到12 766 374條（128 G）、18 583 390條（1.86 G）clean reads，分別占原始數據的98.2%、98.1%，堿基錯誤率均為0.04%，GC含量分別為50.1%、52.1%。在S5、S8時期被成功注釋有差異表達的基因序列2 316條，其中在S8時期中表達量下調的基因序列有925條（39.9%），上調的有1 392條（60.1%）。

2.2 差異表達基因的GO富集分析

差異基因GO富集分析中共有1 656條差異基因，以生物學過程（biological process，BP；圖2）、細胞組分（cellular component，CC；圖3）及分子功能（molecular function，MF；圖4）三大類的60個亞類（各20個亞類）進行功能注釋，共得到2 626個GO注釋結果，以富集程度最高的60個GO注釋作圖。其中生物學過程中，代謝過程（metabolic process GO：0008152）被注釋到的差異基因序列最多，達1 082條（67.87%）；其次是單細胞代謝過程（single-organism metabolic process GO：0044710），有501條（32.72%）有表達量變化。在細胞組分功能分類中的差異基因數量相對較少，質體（plastid GO：0009536）、葉綠體（chloroplast GO：0009507）、類囊體（thylakoid GO：0042651）及光合作用膜上（photosynthetic membrane GO：0034357）的差異基因數量在該功能分類中相對較多。在分子功能的分類中，催化活性（catalytic activity GO：0003824）和氧化還原酶活力（oxidoreductase activity GO：0016491）注釋到的差異基因數量最多，分別為927條（56.9%）、252條（15.2%）。

2.3 差異表達基因的KEGG富集分析

對差異基因進行KEGG富集分析，得到差異基因所參與的主要代謝途徑有170條，主要富集在次生代謝產物生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、不同環境微生物代謝（microbial metabolism in diverse environments）、內質網蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）等途徑（表1），本研究主要研究在紅掌佛焰苞顏色變化過程中關鍵基因的表達情況，注釋得到在類黃酮生物合成途徑（flavonoid biosynthesis）中差異表達的基因數量有11條，通過代謝路徑分析，該11條基因序列參與花青素生物合成途徑，與S5時期（盛花期）相比，S8時期（衰老期）均表現為表達量下調。預測該11條基因序列為控制紅掌佛焰苞顏色變化的關鍵基因，通過NCBI序列比對，被注釋為8種基因，分別為C4H（肉桂酸-4-羥化酶）、CHS、CHI、DFR、F3′H、F3H、ANS、LAR。選其中感興趣的4個基因序列，同時設計其特異擴增引物進行后續分析（表2）。

2.4 實時定量PCR驗證結果

對篩選出的4個關鍵基因，在紅掌佛焰苞的S5、S8時期進行實時定量PCR驗證其基因表達水平。圖5結果表明，comp52649_c2（C4H）、comp46425_c0（CHI）、comp53291_c0（DFR）、comp41735_c0（F3H）這4條基因在S8時期中表達量均有不同程度下調，每條序列表達量下調倍數都高于DGE測序結果，其中comp41735_c0下調倍數較多。分析原因可能是因為熒光定量擴增的是特異片段且具有較高的靈敏性，同時也與材料的選擇時期偏差有關。熒光定量結果與DGE測序結果趨勢基本一致，說明測序結果有較好的準確性。

2.5 花青素代謝途徑中關鍵基因在紅掌佛焰苞各時期表達水平分析

通過實時熒光定量PCR檢測4個關鍵基因在紅掌佛焰苞發育時期的表達水平。圖6結果表明：CHI在佛焰苞發育初期表達量規律不穩定，在S3時期中表達量最高，其次是S1時期，在S2時期中表達量下降明顯，在S5、S6、S7、S8時期中，隨著佛焰苞的衰老，其表達量逐漸降低；C4H、F3H、DFR基因在佛焰苞初期相對表達量隨著佛焰苞的生長逐漸增高，其中C4H、F3H在S3時期達到最高，DFR在S4時期中表達量最高；S4時期之后，4個基因均隨著佛焰苞的成熟，表達量逐漸下降；在S8衰老期，相對表達量均達到最低水平。由結果可知，S3時期是紅掌花青素合成的高峰期，隨著佛焰苞生長，花青素含量下降是導致佛焰苞顏色變綠的原因。

3 討論與結論

類黃酮類物質具有生物功能多樣性，包括抗植物病原體、參與植物激素調節反應等[13-14]；同時使植物花瓣呈現出紅色、藍色、紫色和橙色，這種進化可以吸引傳粉者并利于種子的傳播，也可以對自身進行保護[15]。黃酮類物質中的花青素是紅掌佛焰苞呈色的主要物質。目前，花青素生物合成途徑在其他花卉中研究的較為清楚，經過該途徑合成的天竺葵色素苷、矢車菊色素苷和飛燕草色素苷是形成有色花的主要色素物質[16]。

本研究中得到在紅掌佛焰苞花青素生物合成途徑中表達量變化的11條基因序列，通過NCBI數據庫比對注釋為8種基因，分別為C4H、CHS、CHI、DFR、F3H、F3′H、ANS和LAR，總結出這8種基因是控制該途徑的關鍵基因。選出重要的4條基因序列comp52649_c2（C4H）、comp46425_c0（CHI）、comp41735_c0（F3H）和comp53291_c0（DFR），探究其在紅掌佛焰苞發育過程中基因表達水平。其中C4H是催化花青素生物合成途徑第1階段第2步反應的關鍵酶[17-18]；Millar等研究表明，C4H的表達豐度對黃酮類化合物的生物合成量有一定影響[19]。本研究表明，隨著紅掌佛焰苞的生長，C4H先升高再降低，表明紅掌黃酮類物質在此過程中的含量變化是導致紅掌顏色變化的主要原因之一。CHI是查爾酮生成4′，5，7-三羥基黃烷酮過程的催化酶，可將該反應效率提高 7～10倍[20]，CHI與黃酮類物質合成密切相關，通過調節CHI表達量可進行花色改良，如利用RNA干擾技術抑制煙草的CHI合成，得到黃色花瓣；在康乃馨中的CHI、DFR插入轉座子得到黃色品種。在本研究中紅掌佛焰苞由紅色變為綠色過程中，CHI表達量下降明顯，表明該基因的表達豐度下降與佛焰苞顏色變化有關，而在佛焰苞前期發育時期表達量變化不穩定，具體原因有待進一步驗證。F3H屬氧化戊二酸依賴型加氧酶，具有底物特異性，反應需依賴Fe2+、O2-、2-酮戊二酸等作為輔助因子，在植物類黃酮生物合成調控中起著關鍵的作用[21]。在本試驗中，F3H在佛焰苞S3時期高表達，說明S3時期是紅掌花青素合成的旺盛時期；DFR是ADPH依賴性短鏈還原酶家族成員[22]，Collette等對紅掌的研究中發現，DFR的轉錄水平在不同的發育階段有顯著差異，在佛焰苞發育過程中DFR是一個關鍵基因[23]。在本試驗中，DFR基因表達量在紅掌佛焰苞發育初期逐漸升高，在S3時期達到最高值，隨著佛焰苞的成熟和衰老，表達量逐漸降低，S8時期達到最低值，這與Collette等研究結果[23]一致，說明DFR是紅掌佛焰苞發育過程中花色變化的關鍵酶。

本研究利用DGE測序技術得到紅掌在S5、S8時期的差異基因信息，為后續研究紅掌佛焰苞花色基因功能等奠定基礎；測序結果結合實時熒光定量PCR試驗，得到控制紅掌佛焰苞花青素生物合成途徑中的11條關鍵基因序列，并對其中的4條基因進行表達量分析，得到C4H、CHI、DFR、F3H是控制紅掌佛焰苞顏色變化的關鍵基因，S3時期是紅掌花青素合成的高峰期，為紅掌佛焰苞花色基因定位、全長克隆及相關基因轉錄因子的研究打下基礎。

參考文獻：

[1]Gantait S，Mandal N，Bhattacharyya S，et al. In vitro mass multiplication with pure genetic identity in Anthurium andreanum Lind[J]. Plant Tissue Cult Biotech，2008，18（2）：113-122.

[2]戴思蘭. 園林植物遺傳學[M]. 北京：中國林業出版社，2005：179-186.

[3]Iwata R Y，Tang C S，Kamemoto H. Concentration of anthocyanins affecting spathe colour in Anthuriums[J]. J Am Soc Hort Sci，1985，110（3）：383-385.

[4]Martin C，Gerats T. Control of pigment biosynthesis genes during petal development[J]. The Plant Cell，1993，5（10）：1253-1264.

[5]Martin C，Jin H，Schwinn K. Regulation of phytochemicals by molecular techniques[M]//Romeo J T，Saunders J A，Matthews B F. Beltsville，Maryland，USA：Pergamon，2001：155-169.

[6]Holton T A，Cornish E C. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J]. The Plant Cell，1995，7（7）：1071-1083.

[7]Liang P，Pardee A B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction[J]. Science，1992，257（572）：967-971.

[8]Li B，Dewey C N. RSEM：accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome[J]. BMC Bioinformatics，2011，12：323.

[9]Audic S，Claverie J M. The significance of digital gene expression profiles[J]. Genome Research，1997，7（10）：986-995.

[10]Young M D，Wakefield M J，Smyth G K. Gene ontology analysis for RNA-seq：accounting for selection bias[J]. Genome Biology，2010，11（2）：r14.

[11]Kanehisa M，Araki M，Goto S，et al. KEGG for linking genomes to life and the environment[J]. Nucleic Acids Research，2008，36（Database issue）：D480-D484.

[12]Gopaulchan D，Lennon A M，Umaharan P. Identification of reference genes for expression studies using quantitative RT-PCR in spathe tissue of Anthurium andraeanum （Hort.）[J]. Scientia Horticulturae，2013，153：1-7.

[13]Mol J，Grotewold E，Koes R. How genes paint flowers and seeds[J]. Trends Plant Sci，1998，3：212-217.

[14]Winkel-Shirley B. Biosynthesis of favonoids and effects of stress[J]. Current Opinion in Plant Biology，2002，5（3）：218-223.

[15]To K Y，Wang C K. Floriculture，ornamental and plant biotechnology advances and tropical issues[M]. Isleworth，UK：Global Science Books，2006：300-310.

[16]韓科廳，胡 可，戴思蘭. 觀賞植物花色的分子設計[J]. 分子植物育種，2008，6（1）：16-24.

[17]Barber M S，Mitchell H J. Regulation of phenylpropanoid metabolism in relation to lignin biosynthesis in plants[J]. Int Rev Cytol，1997，172：243-293.

[18]李 波，梁 穎，柴友榮. 植物肉桂酰輔酶A還原酶（CCR）基因的研究進展[J]. 分子植物育種，2006，4（增刊1）：55-65.

[19]Millar D J，Long M，Donovan G，et al. Introduction of sense constructs of cinnamate 4-hydroxylase （CYP73A24） in transgenic tomato plants shows opposite effects on flux into stem lignin and fruit flavonoids[J]. Phytochemistry，2007，68（11）：1497-1509.

[20]Li F，Jin Z，Qu W，et al. Cloning of a cDNA encoding the Saussurea medusa chalone isomerase and its expression in transgenic tobacco[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2006，44（7/8/9）：455-461.

[21]Owens D K，Mclntosh C A. Biosynthesis and function of Citrus glycosylated flavonoids[M]. New York：Springer，2011：67-95.

[22]Martens S，Teeri T，Forkmann G. Heterologous expression of dihydronavonol 4-reductases from various plant[J]. Febs Letters，2002，531（3）：453-458.

[23]Collette V E，Jameson P E，Schwinn K E，et al. Temporal and spatial expression of flavonoid biosynthetic genes in flowers of Anthurium andraeanum[J]. Physiologia Plantarum，2004，122（3）：297-304.