紅掌佛焰苞數(shù)字基因表達譜及關(guān)鍵基因表達水平分析

彭佳佳+劉克林+劉麗婭+呂學(xué)華+楊哲+李佩愉+劉春+明軍+袁素霞+平吉成+張黎

摘要： 以紅掌佛焰苞S5（盛花期：紅色）、S8（衰老期：綠色）時期為試驗材料進行數(shù)字基因表達譜（digital gene expression profiling，DGE）測序，分別得到12 766 374條（1.28 G）、18 583 390條（1.86 G）可分析序列（clean reads），被成功注釋有差異表達的基因序列2 316條。為探究紅掌佛焰苞顏色變化過程中關(guān)鍵基因的表達水平，將差異基因定位在花青素生物合成途徑11條表達量變化的序列上，并通過實時熒光定量PCR對其中的4條序列進行檢驗，驗證了DGE測序結(jié)果的準確性。同時研究這4個序列在紅掌佛焰苞生長過程中的表達水平，結(jié)果表明：在佛焰苞發(fā)育初期，3條序列相對表達量逐漸增高，1條在S2時期降低，但均在S3時期達到最高或較高值；在S4、S5、S6、S7、S8時期，隨著佛焰苞的成熟，4條序列表達量大體上均逐漸下降，在S8衰老期表達量最低。研究結(jié)果證明了這4條基因序列是紅掌佛焰苞花色形成中的關(guān)鍵基因，S3時期是花青素生物合成的高峰期。

關(guān)鍵詞： 數(shù)字基因表達譜；紅掌佛焰苞；花青素；基因表達水平；基因序列；關(guān)鍵基因；花色變化；關(guān)鍵酶

中圖分類號： S682.03 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0048-05

紅掌（Anthurium andraeanum）為天南星科花燭屬多年生常綠草本植物，原產(chǎn)于中美洲、南美洲熱帶地區(qū)[1]，以其花色豐富艷麗的心形佛焰苞片和持久的花期廣受消費者喜愛。花色是花卉重要的觀賞性狀，花色的形成主要是由不同類型花色素在花瓣中的積累決定的[2]。Iwata等研究表明，紅掌花青素主要有花色苷、花葵苷2種，并且花色與這2種色素苷的比例有關(guān)[3]。花青素在花瓣的生長發(fā)育過程中會發(fā)生一系列變化，其合成也受相關(guān)合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平所控制[4-6]。

數(shù)字基因表達譜（DGE）是利用新一代高通量測序技術(shù)對某物種的特定組織在特定狀態(tài)下基因的表達量變化情況進行檢測的結(jié)果，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)等領(lǐng)。通過DGE可以篩選出有差異表達的基因序列信息，研究基因表達量的變化是調(diào)控細胞生命活動過程的核心機制[7]。

紅掌佛焰苞在生長發(fā)育過程中會由紅色逐漸變?yōu)榫G色，這與其花青素生物代謝合成過程中關(guān)鍵基因的表達量存在一定的關(guān)系。本試驗通過對紅掌佛焰苞S5、S8時期進行DGE測序，得到在紅掌顏色變化過程中存在差異表達的基因序列，并選擇有關(guān)基因探究其在紅掌佛焰苞生長發(fā)育過程中的表達水平，為紅掌花色基因全長克隆、分子標記，及改良育種等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自北京大興苗圃2年生火焰（Dakota）2個生長期：S5（盛花期），佛焰苞全部展開，肉穗上部黃色，下部白色（此時為商品最佳觀賞期）；S8（衰老期），佛焰苞全部轉(zhuǎn)為綠色，肉穗變?yōu)樯罹G色（圖1）。采取健康佛焰苞于-80°C貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

總RNA提取采用植物RNA提取試劑盒Esayspin，購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR，購自invetrogen公司；熒光定量試劑盒：FastStart Universal SYBR Green Master （ROX），購自Roche公司；Taq DNA聚合酶，由天根生化科技（北京）有限公司提供。試驗用到的主要儀器有PCR儀、ABI7900HT熒光定量PCR儀、臺式離心機、超低溫高速離心機、恒溫水浴鍋、制冰機、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)及超凈工作臺等。引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。試驗對紅掌的S5（盛花期：紅色）、S8（衰老期：綠色）進行的DGE測序，由北京諾禾致源科技有限公司完成。

1.3 植物總RNA提取

植物總RNA提取方法按照Esayspin試劑盒說明書進行，提取結(jié)果用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。條帶28 S ∶ 18 S亮度比約為2 ∶ 1，說明RNA無降解；用Biodrop超微量蛋白核酸分析儀測得D260 nm/280 nm在1.8～2.2之間，則說明RNA質(zhì)量合格，可進行后續(xù)測序試驗。

1.4 紅掌佛焰苞DGE測序

樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用6堿基隨機引物（random hexamers）合成1鏈 cDNA；然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase I合成2鏈cDNA；隨后用AMPure XP beads試劑盒純化雙鏈cDNA。將純化的雙鏈cDNA進行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進行片段大小選擇，最后進行PCR富集得到最終的cDNA文庫。測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司利用Illunima HiSeqTM2000/MiseqTM平臺完成。

1.5 DGE測序結(jié)果分析

測序得到原始測序序列（raw reads），為保證信息分析質(zhì)量，必須對原始測序序列過濾去除里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads（質(zhì)量值sQ≤5的堿基數(shù)占整個reads 50%以上的reads），得到clean reads（指過濾去除里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads后，可以進行后續(xù)分析的可用序列），后續(xù)分析基于clean reads進行。以紅掌轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果為參考序列，基因表達水平以RPKM（reads per kilo bases per million mapped reads）[8]為評估方法。以Audic等方法[9]對2個時期的樣本進行差異基因篩選，后續(xù)對樣本間差異基因功能上的基因本體論（gene ontology，GO）富集分析[10]和這些基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析[11]都基于差異基因。篩選出與紅掌佛焰苞顏色變化有關(guān)的差異基因，驗證DGE測序結(jié)果并探究這些差異基因在紅掌佛焰苞整個發(fā)育過程中的表達水平。

1.6 實時熒光定量PCR 驗證

根據(jù)測序結(jié)果得到紅掌佛焰苞顏色變化的關(guān)鍵差異基因序列，用Primer 5.0設(shè)計特異引物。分別提取紅掌佛焰苞S1至S8整個發(fā)育時期（圖1）的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA進行熒光定量試驗，PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，55°C 60 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。用RQ manager 軟件進行CT值分析，用2-ΔΔCT法計算基因的表達水平。以S5（盛花期：紅色）作為對照時期、紅掌CYP（登陸號：JN602201，CYP-F：5′-TTCGACATGRMRRTCGGCGGC-3′；CYP-R：5′-CGACRTGCTTSCCRTCRAGCC-3′）作為內(nèi)參基因[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DGE測序結(jié)果分析

通過DGE測序，樣本S5、S8分別得到12 766 374條（128 G）、18 583 390條（1.86 G）clean reads，分別占原始數(shù)據(jù)的98.2%、98.1%，堿基錯誤率均為0.04%，GC含量分別為50.1%、52.1%。在S5、S8時期被成功注釋有差異表達的基因序列2 316條，其中在S8時期中表達量下調(diào)的基因序列有925條（39.9%），上調(diào)的有1 392條（60.1%）。

2.2 差異表達基因的GO富集分析

差異基因GO富集分析中共有1 656條差異基因，以生物學(xué)過程（biological process，BP；圖2）、細胞組分（cellular component，CC；圖3）及分子功能（molecular function，MF；圖4）三大類的60個亞類（各20個亞類）進行功能注釋，共得到2 626個GO注釋結(jié)果，以富集程度最高的60個GO注釋作圖。其中生物學(xué)過程中，代謝過程（metabolic process GO：0008152）被注釋到的差異基因序列最多，達1 082條（67.87%）；其次是單細胞代謝過程（single-organism metabolic process GO：0044710），有501條（32.72%）有表達量變化。在細胞組分功能分類中的差異基因數(shù)量相對較少，質(zhì)體（plastid GO：0009536）、葉綠體（chloroplast GO：0009507）、類囊體（thylakoid GO：0042651）及光合作用膜上（photosynthetic membrane GO：0034357）的差異基因數(shù)量在該功能分類中相對較多。在分子功能的分類中，催化活性（catalytic activity GO：0003824）和氧化還原酶活力（oxidoreductase activity GO：0016491）注釋到的差異基因數(shù)量最多，分別為927條（56.9%）、252條（15.2%）。

2.3 差異表達基因的KEGG富集分析

對差異基因進行KEGG富集分析，得到差異基因所參與的主要代謝途徑有170條，主要富集在次生代謝產(chǎn)物生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、不同環(huán)境微生物代謝（microbial metabolism in diverse environments）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）等途徑（表1），本研究主要研究在紅掌佛焰苞顏色變化過程中關(guān)鍵基因的表達情況，注釋得到在類黃酮生物合成途徑（flavonoid biosynthesis）中差異表達的基因數(shù)量有11條，通過代謝路徑分析，該11條基因序列參與花青素生物合成途徑，與S5時期（盛花期）相比，S8時期（衰老期）均表現(xiàn)為表達量下調(diào)。預(yù)測該11條基因序列為控制紅掌佛焰苞顏色變化的關(guān)鍵基因，通過NCBI序列比對，被注釋為8種基因，分別為C4H（肉桂酸-4-羥化酶）、CHS、CHI、DFR、F3′H、F3H、ANS、LAR。選其中感興趣的4個基因序列，同時設(shè)計其特異擴增引物進行后續(xù)分析（表2）。

2.4 實時定量PCR驗證結(jié)果

對篩選出的4個關(guān)鍵基因，在紅掌佛焰苞的S5、S8時期進行實時定量PCR驗證其基因表達水平。圖5結(jié)果表明，comp52649_c2（C4H）、comp46425_c0（CHI）、comp53291_c0（DFR）、comp41735_c0（F3H）這4條基因在S8時期中表達量均有不同程度下調(diào)，每條序列表達量下調(diào)倍數(shù)都高于DGE測序結(jié)果，其中comp41735_c0下調(diào)倍數(shù)較多。分析原因可能是因為熒光定量擴增的是特異片段且具有較高的靈敏性，同時也與材料的選擇時期偏差有關(guān)。熒光定量結(jié)果與DGE測序結(jié)果趨勢基本一致，說明測序結(jié)果有較好的準確性。

2.5 花青素代謝途徑中關(guān)鍵基因在紅掌佛焰苞各時期表達水平分析

通過實時熒光定量PCR檢測4個關(guān)鍵基因在紅掌佛焰苞發(fā)育時期的表達水平。圖6結(jié)果表明：CHI在佛焰苞發(fā)育初期表達量規(guī)律不穩(wěn)定，在S3時期中表達量最高，其次是S1時期，在S2時期中表達量下降明顯，在S5、S6、S7、S8時期中，隨著佛焰苞的衰老，其表達量逐漸降低；C4H、F3H、DFR基因在佛焰苞初期相對表達量隨著佛焰苞的生長逐漸增高，其中C4H、F3H在S3時期達到最高，DFR在S4時期中表達量最高；S4時期之后，4個基因均隨著佛焰苞的成熟，表達量逐漸下降；在S8衰老期，相對表達量均達到最低水平。由結(jié)果可知，S3時期是紅掌花青素合成的高峰期，隨著佛焰苞生長，花青素含量下降是導(dǎo)致佛焰苞顏色變綠的原因。

3 討論與結(jié)論

類黃酮類物質(zhì)具有生物功能多樣性，包括抗植物病原體、參與植物激素調(diào)節(jié)反應(yīng)等[13-14]；同時使植物花瓣呈現(xiàn)出紅色、藍色、紫色和橙色，這種進化可以吸引傳粉者并利于種子的傳播，也可以對自身進行保護[15]。黃酮類物質(zhì)中的花青素是紅掌佛焰苞呈色的主要物質(zhì)。目前，花青素生物合成途徑在其他花卉中研究的較為清楚，經(jīng)過該途徑合成的天竺葵色素苷、矢車菊色素苷和飛燕草色素苷是形成有色花的主要色素物質(zhì)[16]。

本研究中得到在紅掌佛焰苞花青素生物合成途徑中表達量變化的11條基因序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對注釋為8種基因，分別為C4H、CHS、CHI、DFR、F3H、F3′H、ANS和LAR，總結(jié)出這8種基因是控制該途徑的關(guān)鍵基因。選出重要的4條基因序列comp52649_c2（C4H）、comp46425_c0（CHI）、comp41735_c0（F3H）和comp53291_c0（DFR），探究其在紅掌佛焰苞發(fā)育過程中基因表達水平。其中C4H是催化花青素生物合成途徑第1階段第2步反應(yīng)的關(guān)鍵酶[17-18]；Millar等研究表明，C4H的表達豐度對黃酮類化合物的生物合成量有一定影響[19]。本研究表明，隨著紅掌佛焰苞的生長，C4H先升高再降低，表明紅掌黃酮類物質(zhì)在此過程中的含量變化是導(dǎo)致紅掌顏色變化的主要原因之一。CHI是查爾酮生成4′，5，7-三羥基黃烷酮過程的催化酶，可將該反應(yīng)效率提高 7～10倍[20]，CHI與黃酮類物質(zhì)合成密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)CHI表達量可進行花色改良，如利用RNA干擾技術(shù)抑制煙草的CHI合成，得到黃色花瓣；在康乃馨中的CHI、DFR插入轉(zhuǎn)座子得到黃色品種。在本研究中紅掌佛焰苞由紅色變?yōu)榫G色過程中，CHI表達量下降明顯，表明該基因的表達豐度下降與佛焰苞顏色變化有關(guān)，而在佛焰苞前期發(fā)育時期表達量變化不穩(wěn)定，具體原因有待進一步驗證。F3H屬氧化戊二酸依賴型加氧酶，具有底物特異性，反應(yīng)需依賴Fe2+、O2-、2-酮戊二酸等作為輔助因子，在植物類黃酮生物合成調(diào)控中起著關(guān)鍵的作用[21]。在本試驗中，F(xiàn)3H在佛焰苞S3時期高表達，說明S3時期是紅掌花青素合成的旺盛時期；DFR是ADPH依賴性短鏈還原酶家族成員[22]，Collette等對紅掌的研究中發(fā)現(xiàn)，DFR的轉(zhuǎn)錄水平在不同的發(fā)育階段有顯著差異，在佛焰苞發(fā)育過程中DFR是一個關(guān)鍵基因[23]。在本試驗中，DFR基因表達量在紅掌佛焰苞發(fā)育初期逐漸升高，在S3時期達到最高值，隨著佛焰苞的成熟和衰老，表達量逐漸降低，S8時期達到最低值，這與Collette等研究結(jié)果[23]一致，說明DFR是紅掌佛焰苞發(fā)育過程中花色變化的關(guān)鍵酶。

本研究利用DGE測序技術(shù)得到紅掌在S5、S8時期的差異基因信息，為后續(xù)研究紅掌佛焰苞花色基因功能等奠定基礎(chǔ)；測序結(jié)果結(jié)合實時熒光定量PCR試驗，得到控制紅掌佛焰苞花青素生物合成途徑中的11條關(guān)鍵基因序列，并對其中的4條基因進行表達量分析，得到C4H、CHI、DFR、F3H是控制紅掌佛焰苞顏色變化的關(guān)鍵基因，S3時期是紅掌花青素合成的高峰期，為紅掌佛焰苞花色基因定位、全長克隆及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄因子的研究打下基礎(chǔ)。

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