新疆野核桃SRAP—PCR反應體系的優化及引物篩選

張捷+李勤霞+張萍+余甜

摘要： 利用正交設計對新疆野核桃序列相關擴增多態性PCR（SRAP-PCR）反應體系中的5個因素（模板DNA、Mg2+、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶濃度）在5水平上進行優化，對比不同濃度模板DNA對擴增結果的影響，建立了新疆野核桃SRAP最佳反應體系。結果表明，優化的新疆野核桃SRAP-PCR最佳反應體系為：20 μL的反應體系中，2.5 μg/mL模板DNA、0.4 μmol/L引物、2 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、25 U/mL Taq酶U；最佳PCR擴增程序的退火溫度為54 ℃。各因素擴增結果表明，Mg2+濃度對擴增反應結果影響最大，dNTPs濃度影響最小。運用該體系對新疆野核桃樣本進行了驗證，表明該體系擴增穩定可靠。用該體系對100個SRAP引物組合進行篩選，篩選出15個擴增條帶清晰且多態性豐富的引物組合，為新疆野核桃種質資源研究奠定了基礎。

關鍵詞： SRAP分子標記；新疆野核桃；正交試驗；引物篩選；體系優化

中圖分類號： S664.103 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0064-03

新疆野核桃（Juglans regia L.）是胡桃科胡桃屬植物，也是栽培核桃（Uuglms regia L.）的野生種之一[1]，在我國僅分布于新疆伊犁鞏留縣（后稱野核桃溝自然保護區）內，是我國珍貴的天然野生資源[2-4]。

國內目前對于新疆野核桃領域的研究薄弱，而分子標記技術已經在核桃的遺傳多樣性分析[5-13]、分子標記輔助育種[14]、特異性基因標記[15-16]和遺傳圖譜的構建[17]等方面普遍應用，但其飽和程度不高，不能滿足科研工作發展的需要。本研究利用正交設計試驗對新疆野核桃序列相關擴增多態性PCR（SRAP-PCR）反應體系進行了優化[18-20]，考察SRAP-PCR反應體系中各因素的相互影響[21]，得到最佳優化組合。與單因素試驗相比，不但可以快速獲得試驗結果，而且減少了試驗的成本和工作量。并對100對SRAP引物進行了多態性標記篩選，得到一些多態性較高的SRAP引物組合[22-24]，為進一步研究新疆野核桃種質資源遺傳多樣性打下了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 材料 試驗材料為從新疆伊犁鞏留縣野核桃溝內采集的野核桃葉片。

1.1.2 試劑 根據Li等已發表的SRAP引物[25]設計10條正向引物、10條反向引物序列（表1），由深圳華大基因科技服務有限公司合成；10×Taq Buffer（含Mg2+）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Ladder（100 bp）、10×Loading buffer均購于北京全式金生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 以新疆野核桃的幼嫩葉片為材料，利用改良高鹽低pH值法提取基因組DNA[20]，干燥后加入1× TE溶解沉淀，檢驗質量后于-20 ℃條件下長期保存。試驗所提取的DNA沉淀為白色，經風干后呈透明黏狀。在0.8%的瓊脂糖凝膠中，于100 V電壓下電泳1 h，經0.5 μg/mL EB染色，然后在凝膠成像系統下拍照檢測DNA質量。

1.2.2 PCR反應體系優化的正交試驗設計 利用L25（55）正交設計試驗[21]，對模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和Taq聚合酶濃度進行5因素5水平篩選試驗（表2）。

1.2.3 SRAP-PCR擴增程序及擴增產物的檢測 制備總體積為20 μL的PCR 反應體系，除變化因素外，其余的用ddH2O補足，所用的引物組合為F2+R3，引物序列見表1。SRAP-PCR的擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性 1 min，35 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，5個循環；94 ℃變性1 min，54 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。擴增反應在Thermal Cycler S1000型PCR儀上進行，擴增產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（電泳儀電源為 DYY-10C型，電泳儀為DYCZ-20C型），快速銀染法顯色，清水清洗，裹上保鮮膜，最后在膠片觀察燈上觀察并拍照保存。

1.2.4 多態性SRAP引物組合的篩選 根據表2設計的正交優化試驗方案確定新疆野核桃SRAP-PCR的最佳反應體系，用10條正向引物和10條反向引物組成的100對引物組合對48份不同區域的新疆野核桃材料進行多態性SRAP引物組合的篩選。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的提取

利用改良高鹽低pH值法所提取的新疆野核桃基因組DNA，經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示DNA條帶清晰，無拖尾現象，表明DNA完整（圖1）。通過UV2000紫外分光光度計對DNA濃度進行檢測，測得D260 nm/D280 nm的比值在1.8～2.0之間。由此可知，經上述方法提取的新疆野核桃DNA的質量較高，能夠滿足SRAP反應對DNA的要求。

2.2 正交設計優化SRAP-PCR的結果分析

依據“1.2.2”節中設定的正交試驗，進行PCR擴增反應和聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據電泳結果（圖2），統計擴增條帶數量，將結果輸入SPSS 19.0軟件進行方差分析（表3）。

從電泳結果可以看出，第6、10、15泳道電泳條帶多且清晰，都可作為新疆野核桃正交試驗組合，但從經濟性考慮，最后選擇第15個組合為新疆野核桃SRAP-PCR最佳反應組合。

從方差分析中能夠看出，5種PCR因子的F值大小依次為：Mg2+濃度>引物濃度>Taq酶濃度>模板DNA濃度>dNTPs濃度，這表明Mg2+濃度對新疆野核桃SRAP-PCR的反應體系有最大的影響。

依據上述試驗結果，確定新疆野核桃SRAP-PCR的最優反應體系為：2.5 μg/mL模版DNA、2 mmol/L Mg2+、0.4 μmol/L 引物、0.2 mmol/L dNTPs、25 U/mL Taq酶，剩余體積用去離子水補齊至20 μL；最佳PCR擴增程序的退火溫度為 54 ℃，相應SRAP-PCR擴增程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，5個循環；94 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。

2.3 SRAP-PCR反應體系的驗證

從不同引物組合中隨機選取引物分別對48個樣品DNA進行擴增驗證（圖3）。結果表明該反應體系能得到較好的結果，且在不同的引物組合之間和不同的DNA樣品之間帶型有明顯差異，擴增出的譜帶較清晰且多態性較豐富。

2.4 SRAP-PCR多態性引物組合的篩選

應用“2.2”節建立的新疆野核桃SRAP-PCR的反應體系，用由10個上游引物、10個下游引物組成的100對 SRAP-PCR的引物組合對48份新疆野核桃樣品進行SRAP擴增，每個擴增試驗都重復3次，并選取條帶清晰且重復性較好的結果進行分析。最后篩選出15對條帶清晰，多態性好的引物組合：F1/R2、F1/R5、F1/R7、F2/R2、 F2/R3、F2/R4、F3/R2、F3/R3、F3/R4、F5/R1、F5/R2、F5/R5、F6/R8、F6/R9、F6/R10。其中F3/R2擴增結果見圖4。

3 結論與討論

SRAP作為一種新型的分子標記技術，不但具有多態性高、擴增穩定、引物通用和產量中等的特點，而且重復性較好，操作簡易。然而，SRAP分子標記的擴增結果容易受PCR反應條件（比如DNA、dNTPs、Mg2+濃度、引物和Taq聚合酶用量等）和基因組的影響，并且不同的植物對SRAP-PCR反應體系的要求也各不相同[21]。所以，對反應體系進行優化是進行SRAP分析的前提條件。

試驗結果表明：Mg2+濃度對SRAP-PCR反應體系的結果影響最大，而模板濃度和退火溫度的變化對SRAP-PCR反應體系影響相對較為輕微。本試驗建立了適合新疆野核桃的SRAP-PCR優化體系，模版DNA濃度為2.5 μg/mL、Mg2+濃度為2.0 mmol/L、引物濃度為0.4 μmol/L、dNTPs濃度為 0.2 mmol/L、Taq酶濃度為25 U/mL，剩余體積用去離子水補齊至 20 μL。利用該體系篩選出15對擴增產物條帶清晰并且多態性較豐富的引物組合。新疆野核桃SRAP-PCR優化體系的建立和引物組合的篩選為野核桃種質資源的遺傳多樣性分析研究奠定了良好的基礎。

利用本研究的反應體系，能擴增出條帶清晰、多態性豐富的譜帶，且重復性好、穩定性強，這為今后新疆野核桃在SRAP這種新型分子標記方面的研究提供了依據，也為新疆野核桃通過SRAP分子標記技術在種質資源遺傳多樣性和野核桃遺傳圖譜的構建方面提奠定了基礎。

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