響應面法對大豆花粉離體萌發主要影響因子的優化

王昌陵+曹永強+張立軍+王文斌+閆春娟+孫旭剛+宋書宏

摘要： 以遼寧省審定的大豆品種遼豆15號花粉為材料，探討大豆花粉在離體培養條件下萌發、生長的主要影響因子。采用單因素試驗篩選出大豆花粉萌發培養基最佳碳源為蔗糖，Ca2+源為CaCl2，有效植物生長調節劑為GA3。通過Plackett-Burman設計法對影響大豆花粉管生長的8個因素進行了評價，篩選出具有顯著效應的3個因素：初始pH值、蔗糖、GA3。用最陡爬坡路徑逼近花粉管長度響應區域，通過響應面法確定主要影響因素的最佳水平組合。結果表明，大豆花粉離體萌發的各影響因子的最佳水平組合為蔗糖濃度19.2%、GA3 68.9 mg/L、初始pH值6.47、H3BO4 0.015%、CaCl2 0.05%、PEG-4000 7.5%、溫度25 ℃、時間3 h。優化后離體培養花粉管長度達391.95 μm，比優化前提高32.68%。

關鍵詞： 大豆花粉；萌發；Plackett-Burman設計；響應面法；優化

中圖分類號： S565.103 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0094-05

高等植物有性生殖過程中，花粉萌發是極為重要的環節[1]。花粉萌發率、花粉管長度是直接反映植物生殖活力的主要標志。在大豆常規育種過程中，對親本進行選擇配制以及開展雜交大豆育種、不育系研究，都涉及到大豆花粉的萌發問題[2-4]。花粉萌發時花粉粒吸水膨大，花粉粒內壁沿萌發孔向外突出，最后形成花粉管[5]，是極為復雜的生理過程[6]。花粉離體萌發需要碳源[7]、礦物質元素及生長調節劑[8]的參與，只有在培養基中含有足量且合適的營養組分并在適宜的pH值、溫度等條件下，花粉才能正常萌發生長[9]。由于涉及到多個可變因子，如何快速有效地篩選出主要因素并進行優化是該研究領域的關鍵問題之一。Plackett-Burman（PB）設計法是一種經濟有效的二水平試驗設計方法[10]，可以利用最少的試驗次數，從眾多考察因素中快速有效地篩選出主要的影響因素[11-12]。響應面法（response surface methodology，RSM）是一種優化生物過程的綜合技術，可同時對影響生物產量的因子水平及交互作用進行優化與評價[13]，快速有效地確定多因子系統的最佳條件，該法已被廣泛應用于生物過程優化[14]。大豆花粉萌發能力的差異直接影響對大豆有性繁殖能力及育種價值評價結果。前人對于大豆花粉離體培養報道較少。本研究應用Plackett-Burman（PB）設計法篩選影響大豆花粉萌發的主要因素，并通過響應面法確定主要影響因素的最佳水平組合，對大豆花粉萌發培養條件進行優化，旨在為大豆雜交育種、親本配制研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試大豆品種為遼豆15號，為筆者所在單位選育的北方春大豆品種，種植于遼寧省農業科學院試驗田內。

1.2 花粉采集方法

7月中上旬R2時期（盛花期），于發育正常的植株上選取花蕾，花蕾大小盡量一致，并符合當日可做雜交父本的標準，用鑷子取下后置于干凈離心管內放于4 ℃冰箱保存，當日使用。

1.3 花粉培養方法

采用液體培養基培養花粉[15]。按照不同試驗處理配制液體培養基，用移液器滴1滴在凹形載玻片上。將花蕾的萼片、花瓣剝開，用鑷子夾取花藥在液滴表面快速輕蘸一下，使花粉在培養基上分散開即可。為保持濕度，將載玻片放在鋪有濕濾紙的培養皿中，置于恒溫培養箱內25 ℃靜置培養 3 h。培養結束放4 ℃冰箱保存。

1.4 花粉發育指標的測定

1.4.1 萌發率的測定 培養后使用萊卡DM750型顯微鏡進行觀測。當花粉管的長度大于花粉粒的直徑時計為萌發。統計萌發、未萌發的花粉粒數，萌發率計算公式如下：萌發率=萌發的花粉數/總的花粉數×100%。每個試驗處理隨機選取3個視野，每個視野所統計的花粉粒不少于100粒。

1.4.2 花粉管長度的測定 選取已萌發的花粉，用顯微鏡隨機選取3個視野拍照，用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量花粉管的長度。每個樣品至少測定50個花粉管，計算平均長度、標準差。

1.5 單因素試驗

以30 mmol/L MES為母液，加入10%蔗糖+0.05% CaCl2+0.02%H3BO4+10%PEG-4000等成分，pH值調至6.0，作為基礎培養基。探討碳源、Ca2+、植物生長調節劑等單因素對大豆花粉萌發率及花粉管長度的影響時，保持基礎培養基的其他組分不變，只改變探討因素的種類、濃度，在相同條件下培養并測定花粉發育指標[16]。

1.5.1 碳源的選擇試驗 分別使用蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、山梨醇作為碳源，濃度均為10%。

1.5.2 Ca2+源的選擇試驗 分別使用CaCl2、Ca（NO3）2作為Ca2+來源，Ca2+濃度均為0.05%。

1.5.3 植物生長調節劑的選擇試驗 分別在基礎培養基（CK）中加入10 mg/L萘乙酸（NAA）、100 mg/L赤霉素（GA3）、10 mg/L 2，4-D、50 mg/L 6-BA等植物生長調節劑[17]。

1.6 Plackett-Burman（PB）設計[18]

根據單因素試驗確定的培養基組分及前期研究確定的各組分濃度范圍，對影響花粉萌發的8個因素進行考察。按PB設計安排主要影響因素的篩選試驗，每個因素選取低濃度和高濃度分別作為PB試驗中的低水平“-1” “+1”，響應值為花粉管長度（μm），自變量及其代號編碼和水平見表1[ 19]。

1.7 最陡爬坡試驗

根據PB試驗所得的回歸模型，由主要影響因素的偏回歸系數確定蔗糖、GA3、初始pH值的最速增長步長[20]，試驗設計見表2。

1.8 響應面法（RSM）

通過最陡爬坡試驗趨近最優點的臨近區域后，采用中心組合設計（central composite design，CCD）構建模型，以響應面法尋找最優培養條件[21]。選取花粉管長度為響應值，自變量為主要影響因素的水平。各因素編碼水平見表3。

1.9 數據分析

采用Design-Expert軟件和Microsoft Excel軟件統計分析數據。

2 結果與分析

2.1 花粉萌發及花粉管生長的單因素選擇試驗

2.1.1 碳源的選擇 由圖1可知，幾種常見碳源中，蔗糖最易被大豆花粉利用，蔗糖處理下大豆花粉萌發率（68.96±3.01）%及花粉管長度（295.41±26.51） μm均為最高值；其次為麥芽糖，萌發率為（60.00±4.22）%，花粉管長度為（249.77±15.23） μm；葡萄糖、山梨醇等碳源對大豆花粉萌發的促進作用較小。各碳源對萌發率、花粉管長度的影響達極顯著水平。由此確定大豆花粉萌發培養中選擇蔗糖作為碳源。

2.1.2 Ca2+源的選擇 使用CaCl2作為Ca2+來源進行培養，大豆花粉萌發率為（68.96±3.01）%，花粉管長度為（295.41±26.51） μm，均高于使用Ca（NO3）2作為Ca2+來源的萌發率（57.98±4.93）%和花粉管長度（219.33±29.61） μm。由此確定選擇CaCl2在大豆花粉萌發培養中作為Ca2+來源。

2.1.3 植物生長調節劑的選擇 由圖2可以看出，不同的植物生長調節劑對大豆花粉萌發影響不同。添加GA3后，大豆花粉萌發率、花粉管長度分別為（75.65±2.74）%、（325.19±13.59） μm，均高于對照的萌發率（68.96±3.01）%、花粉管長度（295.41±26.51） μm；添加NAA后，萌發率（72.32±3.74）%比對照略有增加，花粉管長度（277.61±13.81） μm有所降低；添加2，4-D、6-BA均抑制了大豆花粉萌發。因此在培養基中加入合適濃度的GA3對大豆花粉萌發有促進作用。

2.2 大豆花粉萌發主要影響因素的確定

利用Design-Expert軟件對Plackett-Burman試驗結果（表4）進行分析，得到響應值（花粉管長度）與各因素間的回歸模型：

式中：y為花粉管長度的預測值，x1、x2、…、x8為自變量編碼值。

由表5可知，該模型極顯著（P<0.01）；模型的調整確定系數為R2Adj=0.961 4，說明該模型能解釋96.14%響應值的變化，試驗誤差小，因而該模型是合適的。x1、x5、x6為顯著影響因素（P<0.05），且均為正效應，因此選取這3個因素的中心水平為原點進行下步優化。x3為負效應，取低水平值；其他因素取中間水平。

2.3 最陡爬坡試驗

根據模型（1），得出x1、x5、x6的最速增長步長，由此形成12個試驗點的最陡爬坡試驗方案，實施結果見表6。由表6可以看出，直到第10個試驗點響應值都是增加的，以后花粉管長度逐漸減小，說明花粉萌發的最優條件在蔗糖18.75%、GA3 62 mg/L、初始pH值為6.5附近區域，因此采用RSM擬合新的二階模型進一步優化。

2.4 響應面法優化培養條件

2.4.2 響應面交互作用分析及優化 RSM圖形是響應值（y）對各試驗因素x1、x5、x6所構成的三維空間曲面圖，從RSM分析圖上可以找出最佳參數以及各參數之間的相互作用，從RSM等高線圖上可以直觀地反映出各因素對響應值的影響，從而分析各交互作用對花粉管長度的影響。

由圖3、圖4、圖5可以看出，蔗糖濃度、GA3濃度、初始pH值各因素之間存在著明顯的交互作用，且在低水平范圍內，同時升高各因素可以提高花粉管生長量；提高過大會抑制花粉管生長。通過對模型（2）求導和解逆矩陣，可以得到模型的極值點：蔗糖19.2%、GA368.9 mg/L、初始pH值6.47、H3BO4 0.015%、CaCl2 0.05%、PEG-4000 7.5%、溫度25 ℃、時間 3 h，此時模型預測的最大響應值為394.56 μm。采用上述優化條件進行培養驗證試驗，得到花粉管長度為 391.95 μm，與預測值相近，證明該模型能較好地預測花粉管生長；優化后花粉萌發水平（花粉管長度391.95 μm）比優化前（花粉管長度295.41 μm）提高32.68%。

3 結論與討論

植物花藥中花粉發育過程積累的淀粉是其萌發時重要的能量來源，淀粉積累的程度也可作為衡量花粉成熟的標志之一[22]。但在離體培養環境下，只具備內源的能量供給時難以完成花粉萌發和花粉管生長的過程，還需要通過人工技術盡量滿足植物激素、pH值、溫度等條件。對于一些自然環境下花粉難以萌發的珍貴物種，要以人工手段模擬甚至超越自然條件才能輔助其完成生殖過程。因此對于花粉離體培養萌發中涉及的各種因素及其重要性，需要進行系統地分析優化。生物過程優化常用單因素法、正交法。單因素法只針對某一因素的影響，常用于確定某一因素的范圍，不能反映多因素的綜合效應，難以取得優化的最佳結果。正交法研究多因素多水平組合是一種高效率、經濟的試驗方法，但只能對孤立的試驗點進行分析，考慮因素之間的交互作用時，正交試驗次數會大大增加。單因素試驗確定初始培養條件后，采用Plackett-Burman設計法，可以用較少的試驗次數從眾多相關影響因素中篩選出主要影響因素，為進一步的優化試驗指明方向。響應面分析法是1951年Box-Wilson開發的一種用于化學過程因子優化的綜合性方法，采用多元二次回歸模型的方法，擬合各因素與響應值之間的函數關系，可連續地對試驗的各個水平進行分析，能快速對主要影響因素進行優化和評價，用于研究多因子系統中因子交互作用達到最大響應值時所對應的最佳條件[23]，是降低開發成本、優化試驗條件、提高生產效率、解決實際生產問題的更為有效的方法。近幾年，響應面法不僅在化學工業、生物學、醫學以及生物制藥領域得到廣泛應用，而且在食品學、工程學、生態學等方面也得到了應用[24]。同時，響應面法不僅用于各行業的優化，還可以用于動力學常數的確定、酶穩定性、動力學研究。本試驗采用Plackett-Burman設計法、最陡爬坡路徑法和響應面分析法（RSM）中的Central-Composite設計相結合，對大豆花粉萌發的影響因素進行研究，確定了培養基中添加蔗糖、CaCl2、GA3可以促進花粉萌發；并篩選出蔗糖、GA3、初始pH值為影響花粉萌發的主要因素，且三者均為正效應。響應面法確定最佳培養條件為：蔗糖濃度19.2%、GA3濃度68.9 mg/L、初始pH值6.47、H3BO4 0.015%、CaCl2 0.05%、PEG-4000 7.5%、溫度25 ℃、時間3 h，此條件下，花粉管長度達391.95 μm，比優化前 295.41 μm 提高32.68%。

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