桑粉虱快速分子檢測技術

柴建萍+倪婧+江秀均+羅雁婕+謝道燕+白興榮

摘要： 桑粉虱[Pealius mori （Takahashi）]是我國植桑區重要的桑樹害蟲，在云南植桑區引起危害。針對桑粉虱蟲體小，與其他種類粉虱形態相似導致識別困難的問題，基于線粒體COⅠ分子標記進行桑園及周邊不同寄主植物粉虱種群鑒定的工作，比較與桑粉虱親緣關系較近的6種粉虱COⅠ基因序列，設計桑粉虱種特異性引物sfs5-1/sfs5-2，擴增300 bp片段，建立桑粉虱快速分子檢測技術。該引物只對桑粉虱COⅠ基因具有擴增能力，而對煙粉虱、溫室白粉虱無擴增效果，且對桑粉虱單頭成蟲、卵粒、幼蟲具有較好擴增能力，表現出桑粉虱種的特異性。該引物靈敏性高，對桑粉虱DNA模板最低檢測值為0.15 ng/μL。該檢測技術簡便、高效，可用于桑粉虱鑒定、苗木調運過程害蟲檢測、種群遷移擴散監測及防控機制研究等多個領域。

關鍵詞： 桑粉虱；COⅠ基因；特異性引物；分子檢測

中圖分類號：S433.39 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0145-03

桑粉虱[Pealius mori（Takahashi）]屬同翅目粉虱科害蟲，是對我國農業生產存在較大威脅的6種重要粉虱類害蟲之一[1]。桑粉虱以幼蟲、成蟲刺吸桑葉汁液發生危害，其分泌物導致桑園煤污病流行，造成桑葉品質及產量下降。近年來，國內植桑區域呈現“東桑西移”格局，桑粉虱在云南植桑區暴發危害并呈擴大趨勢。由于各地對桑粉虱種類識別不清楚，缺乏靶標害蟲發生規律、危害習性、藥劑防效等背景知識，導致防治效果低下、防控難度增大。

粉虱類害蟲的形體微小，種內變異普遍，僅憑粉虱成蟲的外觀識別易造成種類鑒定混亂[2]。粉虱分類鑒定依據蛹殼特征而非成蟲特征[3]，蛹殼形狀和顏色，背面特征，邊緣的齒和剛毛，背剛毛和刺毛，胸部和腹部氣管褶、孔、冠、裂等特征是粉虱分類的重要依據[4]。桑粉虱蛹體長0.70～0.80 mm，呈黃褐色，橢圓形；成蟲體長0.70～0.80 mm，體淡黃色，被有白粉[5]，外形與其他種類粉虱極為相似。非專業研究人員很難直觀地將桑粉虱與其他種類粉虱區別開。應用DNA序列的分子標記技術可找出不同生物類群間的遺傳差異，彌補傳統形態分類方法的不足，能較快進行物種鑒定[6]。其中線粒體COⅠ基因被廣泛應用于昆蟲系統發育及近緣種鑒定，在煙粉虱隱種鑒定、遺傳分化研究中發揮重要作用。但在昆蟲種類鑒定時，線粒體COⅠ基因需經PCR擴增、檢測、測序、比對等諸多環節，操作過程耗時、費用高，特別在進行大量樣本鑒定時較為繁瑣。

本研究基于線粒體COⅠ分子標記對桑園及周邊不同寄主植物粉虱種群鑒定的結果，即桑樹上只有桑粉虱1種粉虱類害蟲危害，而桑園周邊蔬菜及經濟作物以煙粉虱B型、溫室白粉虱發生危害[7]。比較桑粉虱、煙粉虱、溫室白粉虱、螺旋粉虱、番荔枝褶粉虱、番石榴黑棒粉虱、伯粉虱等7種粉虱COⅠ基因序列，根據桑粉虱COⅠ基因的種間特異性設計引物，通過PCR擴增、電泳檢測，建立桑粉虱快速分子檢測技術，以期為植桑區桑粉虱害蟲識別、危害監測及種群發生機制研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲源

桑粉虱采自云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所桑園（2014年6月），蟲態為成蟲、卵、幼蟲。煙粉虱樣本采自桑園周邊寄主植物薄荷（2012年5月），蟲態為成蟲。溫室粉虱采自大棚內寄主植物黃瓜（2012年5月），蟲態為成蟲。煙粉虱及溫室粉虱經過線粒體mt COⅠ分子標記鑒定為煙粉虱B型及溫室白粉虱[7]。

1.2 試驗儀器與試劑

XW-80A渦旋儀（上海精科實業有限公司）；Sorva ll Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機（ThermoFish）；S1000 PCR擴增儀（BIO-RAD）；PowerPac Universal電泳系統（BIO-RAD）；GelDoc TM+XR紫外凝膠成像系統（BIO-RAD）。

DNA提取液：含50 mmol/L Tris-HCl （pH 值8.0）、20 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1% SDS；Tris-EDTA緩沖液：含10 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.0）、1 mmol/L EDTA（pH 值8.0）；蛋白酶K（Merck）、Easy Taq DNA Polymerase、2.5 mmol/L dNTPs，購自Trans（北京）公司；引物由Invitrogen（上海）公司合成；其他無機試劑為國產分析純。

1.3 供試粉虱DNA提取

粉虱DNA提取方法參照柴建萍等方法[7]，分別提取5頭桑粉虱、煙粉虱、溫室白粉虱基因組DNA。收集桑粉虱5個粒卵及5頭2齡幼蟲，進行桑粉虱卵、幼蟲基因提取。

1.4 桑粉虱特異性引物設計

根據柴建萍等報道的桑粉虱（登錄號：KP168713）測序結果[7]，以及NCBI數據庫中公開的煙粉虱（Bemisia tabaci）（登錄號：KF059959）、溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）（登錄號：HM185763）、螺旋粉虱（Aleurodicus dispersus）（登錄號：KC822648）、番荔枝褶粉虱（Aleurotrachelus anonae） （登錄號：HM150624）、番石榴黑棒粉虱（Aleuroclava guyavae）（登錄號：JQ340179）、伯粉虱待定種（Metabemisia sp.）（登錄號：JQ340198）7種粉虱COⅠ堿基序列，應用CLUSTAL X 2.1、MEGA5軟件進行序列對比分析；用Primer Premer 5.0軟件設計桑粉虱特異性引物并進行評價。

1.5 引物特異性驗證

分別以鑒定為桑粉虱、煙粉虱B型、溫室白粉虱的各5頭成蟲的DNA為模板，用設計引物sfs5-1/sfs5-2進行PCR擴增驗證引物特異性。PCR擴增體系為25 μL，其中含 2.5 μL 10×buffer，1.9 μL 2.5 μmol/L dNTPs，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，0.2 μL 5 U/L Taq DNA聚合酶，1.8 μL 100 μg/mL DNA模板，加ddH2O補足。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個循環；72 ℃ 10 min。取5 μ L 擴增產物，加1 μL載樣緩沖液于1%瓊脂糖凝膠中，在100 V電壓下電泳15 min后，用紫外凝膠成像系統檢測電泳結果。

1.6 引物靈敏性檢測

以桑粉虱5頭幼蟲、5粒卵提取的基因組DNA為模版，用引物sfs5-1/sfs5-2進行PCR擴增檢測有效性；檢測桑粉虱DNA模板濃度，并將模板濃度按1、10、102、103、104倍數稀釋成系列濃度梯度，用引物sfs5-1/sfs5-2進行PCR擴增檢測其靈敏性。PCR體系及反應條件同“1.5”節。

2 結果與分析

2.1 引物的選擇

通過桑粉虱與NCBI數據庫公開的共7種粉虱COⅠ基因序列對比分析，設計桑粉虱特異性引物sfs5-1/sfs5-2，上游引物sfs5-1為5′-GTGGATTTGGGAACTGACTA-3′，下游引物sfs5-2為5′-GTGACATTCCTAAGGTTCGT-3′，預計擴增產物為300 bp。

2.2 引物特異性驗證結果

選擇引物sfs5-1/sfs5-2對桑粉虱及桑園周邊煙粉虱B型、溫室白粉虱基因組DNA進行PCR擴增，電泳檢測結果表明，桑粉虱基因組DNA均可擴增出約300 bp目的條帶，而煙粉虱及溫室白粉虱基因組DNA未見目的條帶（圖1）。3種粉虱各重復5頭成蟲基因組擴增得到的結果一致，說明引物sfs5-1/sfs5-2在3種粉虱中具有桑粉虱種的特異性。

2.3 引物靈敏性檢測

引物sfs5-1/sfs5-2對桑粉虱幼蟲及卵基因組均可擴增出約300 bp目的條帶，說明設計的引物對桑粉虱卵、幼蟲、成蟲各蟲態具有良好擴增能力（圖2）。桑粉虱DNA模板按1、10、102、103、104倍數稀釋后分別得到1.5 ng/μL、0.15 ng/μL、15 pg/μL、1.5 pg/μL、0.15 pg/μL系列梯度濃度，經過引物sfs5-1/sfs5-2 的PCR擴增、靈敏度檢測，表明該引物對模板濃度的最低檢測值為 0.15 ng/μL，引物靈敏性較高（圖3）。

3 結論與討論

對于形態特征不穩定或多變異性的昆蟲，特別是近緣種的區別和疑難種的鑒定，PCR擴增分子標記技術可解決傳統形態分類難以解決的難題且不受蟲態影響[6，8]。其中線粒體COⅠ基因已廣泛用于近緣種間系統進化研究，并已應用于粉虱、蚜蟲等多種昆蟲新物種鑒定[9-11]。基于線粒體COⅠ

基因序列分析基礎上發展起來的種特異性鑒定技術，在擴增未知DNA模板時可根據目標片段的有無將目標種類與其他種類鑒別開，由于該技術操作簡便，在粉蚧、實蠅、小蠹蟲、線蟲等害蟲的快速鑒定中被廣泛應用[12-15]。針對較多隱種分化的煙粉虱，通過對多個隱種mtCOⅠ序列限制性內切酶位點分析，篩選特定的內切酶，利用mtCOⅠPCR-RFLP技術成功鑒定了國內9個煙粉虱隱種[16]。應用隨機擴增多態性DNA（RAPD）技術篩選出溫室白粉虱特異性片段，由此片段設計特定序列擴增（sequence characterized amplified regions，SCAR）特異引物可將溫室白粉虱與其他種粉虱區別開，提高了溫室白粉虱檢測效率[17]。對于入侵性螺旋粉虱、雙鉤巢粉虱，采用其mtCOⅠ基因種的特異性序列，設計各自特異性引物，通過PCR擴增、檢測，成功將靶標粉虱與其他種粉虱區別開，為口岸檢疫、害蟲檢測及監測提供了快速分子鑒定技術[18-19]。

云南蒙自桑園及周邊不同寄主植物粉虱種群鑒定表明，桑樹上僅有桑粉虱1種粉虱害蟲危害；遺傳距離及系統發育聚類分析得出，不同于煙粉虱、溫室白粉虱等多種粉虱，桑粉虱作為獨立分枝存在[7]。東桑西移，伴隨云南省桑園面積擴大，桑粉虱在該省的危害日趨嚴重。建立科學、簡便、高效的桑粉虱檢測技術，對粉虱危害季節的桑粉虱鑒定、種苗調運過程害蟲檢測、種群遷移擴散監測及防控機制研究等有重要的科學意義。

本研究根據與桑粉虱親緣關系較近的6種粉虱mt COⅠ堿基序列，設計桑粉虱特異性引物sfs5-1/sfs5-2，并建立桑粉虱快速分子檢測技術。該引物可將桑粉虱與桑園周邊多發性的煙粉虱、溫室白粉虱區別開，并且對桑粉虱單頭成蟲、卵粒、幼蟲均具擴增能力，產生目的片段約為300 bp。引物靈敏度高，桑粉虱基因組DNA模板最低檢測值為0.15 ng/μL，可用于痕量或可疑蟲態的桑粉虱檢測。煙粉虱、溫室白粉虱是世界性害蟲。螺旋粉虱是1種入侵性害蟲，我國臺灣有64科144種植物受害，海南省有47科120種植物受害[20]。番荔枝褶粉虱、番石榴黑棒粉虱、伯粉虱在國內尚未見報道。本試驗檢測樣本種類有限，僅涉及桑粉虱及廣泛分布危害的煙粉虱、溫室白粉虱，桑粉虱種特異檢測還需更多地域、更多種類粉虱樣本進行驗證。

參考文獻：

[1]任順祥，邱寶利，戈 峰，等. 粉虱類害蟲的監測預警與可持續治理技術透視[J]. 應用昆蟲學報，2011，48（1）：7-15.

[2]孫會忠，董鈞鋒，宋月芹，等. 四種粉虱種群超微形態特征多樣性研究[J]. 應用昆蟲學報，2011，48（1）：70-76.

[3]Martin J H. An identification guide to common whitefly pest species of the world（Homopt Aleyrodidae）[J]. Tropical Pest Management，1987，33（4）：298-322.

[4]宋早芹，季小雨，杜予州，等. 我國桑樹五種常見粉虱的超微結構[J]. 應用昆蟲學報，2011，48（1）：65-69.

[5]屈達才，邱靖蕓，虞崇江. 廣西桑粉虱為害特點及綜合防控措施[J]. 廣西農業科學，2010，41（11）：1187-1190.

[6]閻鳳鳴. 非形態特征在粉虱分類中的運用（同翅目：粉虱科）[J]. 昆蟲分類學報，2001，23（2）：107-112.

[7]柴建萍，劉增虎，羅雁婕，等. 桑園及周邊不同寄主植物粉虱種群鑒定[J]. 南方農業學報，2014，45（11）：1963-1969.

[8]黃可輝，郭瓊霞，虞 赟，等. 分子標記法在昆蟲學研究中的應用[J]. 華東昆蟲學報，2005，14（2）：109-114.

[9]Hebert P D，Cywinska A，Ball S L，et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings Biological Sciences，2003，270（1512）：313-321.

[10]Frohlich D R，Torres-Jerez I，Bedford I D，et al. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers[J]. Molecular Ecology，1999，8（10）：1683-1691.

[11]Wang J F，Jiang L Y，Qiao G X. Use of a mitochondrial COⅠ sequence to identify species of the subtribe Aphidina （Hemiptera，Aphididae）[J]. Zoo Keys，2011，30（122）：1-17.

[12]田 虎，李小鳳，萬方浩，等. 利用種特異性COⅠ引物（SS-COⅠ）鑒別扶桑綿粉蚧[J]. 昆蟲學報，2013，56（6）：689-696.

[13]黃 振，陳韶萍，謝 婧，等. 應用種特異性PCR技術快速鑒定辣椒實蠅[J]. 昆蟲學報，2015，58（4）：460-466.

[14]張總澤，陳 艷，林陽武，等. 雅點六齒小蠹的SS-COⅠ技術鑒定[J]. 安徽農業科學，2014，42（9）：2588-2589，2599.

[15]王 瓊，耿麗鳳，張東升，等. 香蕉穿孔線蟲（Radopholus similis）特異性分子檢測技術研究[J]. 植物病理學報，2011，41（2）：171-177.

[16]秦 麗，王 佳，邴孝利，等. 利用mtCOIPCR-RFLP技術鑒定中國境內九個煙粉虱隱種[J]. 昆蟲學報，2013，56（2）：186-194.

[17]王金娜，王相晶，張友軍，等. 溫室白粉虱SCAR分子鑒定技術的建立及應用[J]. 環境昆蟲學報，2012，34（3）：295-301.

[18]李偉東，劉福秀，韓玉春，等. 螺旋粉虱的分子檢測方法[J]. 植物檢疫，2012，26（5）：9-13.

[19]張桂芬，郭建洋，王 瑞，等. 雙鉤巢粉虱的種特異性SS-COⅠ檢測技術[J]. 生物安全學報，2013，22（3）：157-162.

[20]韓冬銀，劉 奎，陳 偉，等. 螺旋粉虱在海南的分布與寄主植物種類調查[J]. 昆蟲知識，2008，45（5）：765-770，封底.