棉花角斑病菌遺傳馴化體系的建立

王清+梁鵬+李響+劉文波+林春花+鄭服叢+繆衛國

摘要： Xanthmonas citri subsp. malvacearum （Xcm）是棉花角斑病的病原，由于缺乏適合的遺傳馴化體系，難于對其特定的基因進行研究，所以建立高效的基因缺失突變系統，是迫切需要解決的問題。采用去甲基化氮胞苷（5-AZA）馴化野生菌株Xcm 8號小種菌株V8和V8無細胞胞外物（CFEs）馴化重組質粒pK18mobsacB：：N1012及pK18mobsacB：：m762這2種馴化方法，以來自V8的hpaXmN和hpaXm為靶基因驗證其有效性。結果表明，成功獲得了△hpaXmN和△hpaXm突變體；雖然2種馴化方式都能獲得轉化子，但馴化菌株的電轉化效率是馴化質粒的10～100倍。遺傳馴化體系的建立消除了Xcm V8由于限制修飾系統引起的轉化障礙，實現了特定基因的定點突變，為后續獲得Xcm V8其他基因缺失突變體奠定了基礎。

關鍵詞： 棉花角斑病菌Xcm V8；遺傳體系；馴化；定點突變

中圖分類號： S435.621.2+5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0153-05

黃單胞菌屬（Xanthomonas）是植物病原菌中較大的類群[1]，隨著細菌基因組學的發展，幾種主要致病菌[2-3]在 NCBI 里已經得到測序，包括34種Xanthomonas campestris、1種Xanthomonas oryzae、1種Xanthomonas axonopodis。這使得T3SS效應分子[4]、相關效應蛋白[5-6]及hrp基因功能[7]等的研究更加深入。

電轉化技術是自1982年發展起來的，雖然廣泛應用于細菌遺傳轉化的研究，但目前向原核細胞導入外源DNA仍很困難[8]。研究證實，以革蘭氏陰性細菌為代表的Haemophilus parasuis SH0165共有33個限制內切酶和甲基轉移酶基因，限制酶通常和它相伴的修飾酶組合成限制修飾系統，Jansen等于1995年發現限制修飾系統是導致不同菌株轉化效率差異的重要因素[9]。R-M系統由Hha 1 endonuclease和Hha 1 methylase基因構成，有報道認為其能抑制細菌基因組外來的DNA交換引起的變化，降解異源DNA，進而保護細菌[10]。

目前，對存在限制性修飾系統的細菌馴化方法主要有：（1）去甲基化氮胞苷（5-AZA）馴化野生菌株，得到R-M系統突變菌用于遺傳轉化[10]；（2）采用CFEs體外甲基化后的質粒轉化Haemophilus parasuis，轉化效率由0提高到100～1 000 CFU/μg DNA[9]；（3）通過基因敲除構建運動發酵單胞菌的限制修飾系統突變菌以提高電轉效率 [11] 。目前，已經用5-AZA成功馴化的R-M系統突變的黃單胞菌水稻白葉枯病菌有國際通用的PXO99A和中國水稻白葉枯病菌的KS6-6A、OS198A和YN2A[10]。

油菜黃單胞菌錦葵致病變種Xanthmonas citri subsp. malvacearum（Xcm） 是棉花角斑病的致病菌，該病在全世界棉花種植區都會發生，但研究大多集中在棉花角斑病的危害、發病條件及致病小種分化等[12-13]。本研究分別采用馴化方法1和2，以Xcm 的8號小種 V8（簡稱V8）的hpaXmN和hpaXm基因為例[14]，成功獲得△hpaXmN和△hpaXm突變菌，實現特定基因的定點突變，為后續獲得Xcm其他基因缺失突變體奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

大腸桿菌感受態DH5α，購自全式金公司；棉花角斑病菌Xanthmonas citri subsp. malvacearum（Xcm）V8菌株（8號小種），由筆者所在實驗室從棉花上分離；質粒pK18mobsacB，南京農業大學董漢松教授惠贈。

卡那霉素（Km，50 mg/mL）、去甲基化氮胞苷（5-AZA）、Tris-base、乙酸鉀、二硫蘇糖醇、Na2EDTA、冰乙酸、S-腺苷甲硫氨酸溶液（SAM）、異丙醇、苯酚、氯仿等（solarbio）；核酸內切酶BamHⅠ、XbaⅠ、T4 DNA Ligase酶、Primer STAR GXL聚合酶（TaKaRa）；質粒提取試劑盒（南京捷貝斯）、膠回收試劑盒購、純化試劑盒（TaKaRa）、細菌基因組DNA提取試劑盒（天根）。

1.2 主要溶液的配制

參照吳東方的方法[9]配制。

1.3 重組質粒pK18mobsacB：：N1012和pK18mobsacB：：m762的馴化

1.3.1 重組質粒的構建 以V8菌株基因組DNA為模板，利用引物hpaXmN-U-F/hpaXmN-U-R，hpaXmN-D-F/hpaXmN-D-R分別PCR獲得hpaXmN-L 503 bp和hpaXmN-R 525 bp的片段（表1）。再利用hpaXmN-U-F和hpaXmN-D-R將上述2個片段通過overlap PCR[15]融合成1 020 bp的片段。接著對融合片段 BamHⅠ和 XbaⅠ 雙酶切獲得1 012 bp的片段，經T4 DNA Ligase連在經相同酶切的pK18mobsacB上，得重組質粒pK18mobsacB：：N1012。同理引物hpaXm-U-F/hpaXm-U-R，hpaXm-D-F/hpaXm-D-R 分別PCR得hpaXm-L 305 bp和hpaXm-R 473 bp的片段，經上述操作，得重組質粒pK18mobsacB：：m762。所用酶切、連接等方法參照文獻[16]。

1.3.2 重組質粒的馴化 提取V8菌株的CFEs和CFEs體外甲基化質粒的反應體系參照吳東方的方法[9]。

1.4 V8菌株的馴化

挑取活化的V8菌株單菌落接種于濃度為0.1 μmol/L的去甲基化氮胞苷（azacytidine，5-AZA） NA平板，長出單菌落后，挑取單克隆接種于1 μmol/L 5-AZA的NA平板繼續篩選，直至得到適合做遺傳轉化且抗150 μmol/L 5-AZA的V8菌株[10]。

1.5 △hpaXmN和△hpaXm突變體的獲得

通過電轉化（1.8 kV，4 ms，BioRad），將“1.3”節獲得的質粒導入V8菌株感受態細胞中[10]，在NA+Km平板上，28 ℃ 培養3～5 d，篩選抗性菌落，用于后續驗證。

2 結果與分析

2.1 重組質粒馴化成功

2.1.1 重組質粒構建成功 hpaXmN-U-F/hpaXmN-U-R和hpaXmN-D-F/hpaXmN-D-R通過PCR得 hpaXmN-L（圖1泳道1～3）和hpaXmN-R（圖1泳道4～6），利用引物hpaXmN-U-F/hpaXmN-D-R通過overlap PCR，融合成hpaXmN-（L+R） 1 028 bp的片段（圖1泳道7～9）。hpaXm-U-F/hpaXm-U-R和hpaXm-D-F/hpaXm-D-R通過PCR擴增hpaXm-L（圖2泳道1）和hpaXm-R（圖2泳道3），利用hpaXm-U-F/hpaXm-D-R，同上處理得hpaXm-（L+R）778 bp的片段（圖2泳道2）。

將 hpaXmN-（L+R）和pK18mobsacB經 BamHⅠ和XbaⅠ 雙酶切后連接，將重組質粒pK18mobsacB：：N1012轉化DH5α，挑取陽性克隆PCR驗證，1、3、4質粒擴增出1 028 bp片段（圖3-A）；提取1、3、4質粒酶切， 均酶切出1 012 bp的片段（圖4-A），測序比對與hpaXmN-（L+R）序列一致，說明pK18mobsacB：：N1012構建成功。同理將pK18mobsacB：：m762 的單克隆1、2、3、5擴增出778 bp片段（圖3-B）；提取這4個單克隆質粒酶切，1、2質粒酶切出762 bp的片段（圖4-B），測序比對后與hpaXm-（L+R）序列一致，說明pK18mobsacB：：m762構建成功。

2.1.2 重組質粒馴化成功 將未經CFEs馴化的重組質粒電轉菌株V8得不到轉化子（圖5-A），用CFEs馴化pK18mobsacB：：N1012和pK18mobsacB：：m762 后分別電轉菌株V8均能得到轉化子（圖5-B、圖5-C）。

2.2 菌株V8馴化成功

將重組質粒電轉未經5-AZA馴化的菌株V8得不到轉化子（圖6-A），將pK18mobsacB：：N1012和pK18mobsacB：：m762分別電轉經過5-AZA馴化的菌株V8也都能得到轉化子（圖6-B、圖6-C）。

2.3 △hpaXmN和△hpaXm突變體驗證成功

經同源重組得到的轉化子依次在Km和10%蔗糖平板上完成2次同源單交換，故進行分單交換子和雙交換子的驗證。

2.3.1 突變體單交換子驗證 引物hpaXmN-U-F/hpaXmN-D-R驗證△hpaXmN，但缺失片段長僅45 bp，通過PCR無法判斷該片段是否缺失（圖7）。hpaXm-U-F/hpaXm-D-R驗證△hpaXm，通過PCR可知單交換子1、8、11發生單交換（圖8-A）；引物hpaXmF/R驗證△hpaXm時，3、8、11質粒能擴增出長為402 bp的片段（圖8-B），確定8、11質粒發生單交換。

2.3.2 轉化子雙交換驗證 通過hpaXmN-U-F/hpaXmN-D-R對雙交換子基因組DNA進行PCR擴增無法辨別是否突變（圖9），故挑取雙交換子3～9送測。因為hpaXm基因組數據未知，但1.3已擴增出495 bp的hpaXmN-L和 465 bp 的hpaXm-R，與已知序列長度402 bp的hpaXm，組成長度1 362 bp的片段，hpaXmN位于其中496～540號堿基，測序結果該序列缺失（圖10），即獲得△hpaXmN突變體。

利用引物hpaXm-U-F/hpaXm-D-R驗證△hpaXm，顯示雙交換子4～9能擴增出762 bp的條帶，與陽性對照2相比，說明4～9的基因缺失了1段（圖11-A）。hpaXmF/R驗證△hpaXm時，4～9無法擴增出長度402 bp的hpaXm基因（圖11-B），即獲得△hpaXm突變體。

3 討論

基因敲除載體pK18mobsacB是Sehgfer等 1994 年在pK18基礎上導入蔗糖果聚糖酶反向篩選基因sacB改造而成的[17]。該質粒轉化進入宿主細胞后，由于其攜帶的突變基因與宿主菌基因組上的基因同源，經2次同源單交換，即可獲得不含有任何抗性標記基因的突變菌株，符合生物安全性要求，并且篩選效率高，已成功應用于多種黃單胞菌的遺傳轉化[4-5]。

本研究嘗試分別采用CFEs馴化質粒和5-AZA馴化菌株的方法，突破了野生菌株V8限制系統帶來的轉化障礙，獲得△hpaXmN和△hpaXm突變體。目前，CFEs體外甲基化重組質粒的馴化方法僅適用存在R-M修飾系統或者提取條件不適用存在其他限制修飾系統的細菌[9]，且在黃單胞菌中暫時未見報道。本研究用CFEs馴化質粒后電轉黃單胞菌株V8成功，但轉化效率很低，每1×108個感受態細胞僅獲得1～5個轉化子，電轉化頻率為1.0×10-8～1.0×10-7。5-AZA馴化菌株的方法已在黃單胞菌PXO99A上應用成功[10]，V8菌株經過馴化后，每1×108個感受態細胞獲得3～20個轉化子，電轉化頻率為1.0×10-7～1.0×10-6，轉化效率是前者的 10～100倍。關于2種馴化方法同時進行時轉化效率如何，還未展開研究。

雖然黃單胞中存在嚴格的修飾系統，但據報道合適的外源載體如pBluescript KS、pCR2.1-TOPO和pKNG101，已成功實現水稻白葉枯病菌Xoo和細菌性條斑病菌Xoc的基因突變[18-19]。目前，菌株V8轉化效率依然較低，未來仍要尋找穩定的轉化載體。

致謝：感謝南京農業大學董漢松教授、宋從鳳教授、龍菊英老師、沈丹老師、紀洪濤博士、李萍碩士等給予的幫助。

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