人參銹腐病生防用解淀粉芽孢桿菌Y—S—Y12菌株發酵條件的優化

屈俊廷+金海強+沈國娟+楊超博+李熙英

摘要： 研究了解淀粉芽孢桿菌Y-S-Y12菌株液體最佳發酵條件，旨在為提高其活性次級代謝產物的產量提供技術支持。通過不同培養條件、營養條件、單因素試驗和均勻設計試驗，對該菌株的最適發酵條件進行了優化，結果發現，Y-S-Y12菌株的最佳發酵時間為3 d，最佳發酵溫度為28～33 ℃，最佳轉速為150 r/min，最佳裝液量為125 mL（培養容器的容量為250 mL），最佳初始pH值為6，供試培養基中Y-S-Y12菌株在NA培養基中的發酵效果最佳。Y-S-Y12菌株最優配方為1.20 g葡萄糖、3.10 g酵母粉、2.00 g磷酸氫二鉀、24.86 g牛肉膏。

關鍵詞： 解淀粉芽孢桿菌；抑菌率；均勻設計；發酵條件優化；人參銹腐病

中圖分類號： S435.675 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0158-03

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）廣泛分布在自然界中，如植物體內、植物根際、土壤、深海水中均有分布。它們與枯草芽孢桿菌親緣性很高，可以產生對多種真菌與細菌具有抑制作用的多種代謝產物。因為解淀粉芽孢桿菌存在廣泛、易分離、易培養，能抑制植物病害，非致病，安全使用對普通人畜群體無害，而且不污染環境，因而特別受重視[1-5]。將解淀粉芽孢桿菌制成生物制劑，植物花部、枝干、葉、根部都可使用，施用方法可以采取對農作物拌種、灌根、噴施等，可廣泛應用于作物采收前后的病害防治上，也有研究指出可應用于糧食果蔬儲存保鮮上[6]。因此，解淀粉芽孢桿菌在植物病害生物防治方面具有廣闊的應用前景。

Y-S-Y12菌株是金海強等[7-8]從楊樹枝條中分離出來的拮抗菌株。結合形態學、培養特征及分子生物學方法鑒定Y-S-Y12菌株為解淀粉芽孢桿菌，是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，該菌在生長過程中可以產生一系列能夠抑制真菌和細菌活性的代謝物，對植物病原菌具有強烈抑制作用[3，9]。經過田間防病試驗和室內抑菌試驗，Y-S-Y12菌株對人參銹腐病（Cylindrocarpon destructans）的抑制作用最強，同時還有促進人參生長作用。另外，Y-S-Y12發酵濃縮液對人參銹腐病菌也具有較強的抑制活性。有關Y-S-Y12菌株發酵條件優化方面未見報道。對此，進行Y-S-Y12菌株發酵條件的優化試驗，以期為Y-S-Y12菌株的擴大培養以及規模化生產菌劑打下基礎。

1 材料與方法：

1.1 供試菌和培養基

供試菌為人參銹腐病菌和Y-S-Y12菌株，均由延邊大學植物病理實驗室保存。

供試培養基為NA培養基、PDA培養基、KB培養液、LB培養液，NA培養液，PDA培養液、基礎發酵培養基[10]。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及種子菌的制備 將Y-S-Y12菌株轉接在NA培養基中，在25 ℃培養箱中培養48 h后取2環接種在NA培養液中，放入恒溫30.6 ℃，轉速為120 r/min搖床中振蕩培養48 h，得到種子菌。

1.2.2 發酵濃縮液 將不同培養條件的發酵液用 4 000 r/min 離心機分離20 min，再過濾，將濾液濃縮到10%，滅菌待用。

1.2.3 不同培養條件對Y-S-Y12菌株發酵的影響 以溫度為30.6 ℃，種子菌的接種量為1%，轉速120 r/min，培養48 h為基本條件。在基礎條件不變的情況下，不同培養時間（1、2、3、4、5、6、7 d），不同培養溫度（23、28、33、38、43、48、53 ℃），不同轉速（70、90、110、130、150、170、190 r/min），不同裝液量（在250 mL的三角瓶中加入培養基量為50、75、100、125、150、175、200 mL），不同的起始pH值（4、5、6、7、8、9、10）及不同培養基（LB、NA、KB、PDA），測定發酵液在580 nm處的吸光值及發酵濃縮液對人參銹腐病菌的抑菌率，根據不同處理的菌體生長量和抑菌活性的大小確定最佳發酵條件。

抑菌活性測定采用雙層培養基打孔法。先在PDA平板中間放入直徑8 mm的人參銹腐病菌的菌碟1片，在菌碟兩邊1.5 cm處將第2層培養基打孔放置滴200 μL發酵濃縮液（2邊對稱），以只放置人參銹腐病菌菌碟的為對照，每個處理重復3個培養皿，放入20 ℃恒溫箱培養6 d，測人參銹腐病菌菌落直徑，計算抑菌率。

[JZ]抑菌率=[SX（]對照病菌菌落寬度-處理病菌菌落寬度 對照病菌菌落寬度-接種時菌碟寬度[SX）]×100%。

1.2.4 不同碳源對Y-S-Y12菌株發酵的影響 在基礎發酵培養基中氮源含量和其他培養條件不變的情況下[11-13]，分別用蔗糖、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳糖、麥芽糖、淀粉等量替換基礎發酵培養基中的葡萄糖，以基礎發酵培養基作對照，測定不同碳源的發酵無菌液對人參銹腐病菌抑菌活性的影響，抑菌活性大小和菌量測定方法同“1.2.3”節。

1.2.4 不同氮源對Y-S-Y12菌株發酵的影響 在基礎發酵培養基中碳源含量和其他培養條件不變的情況下，分別用牛肉膏、硝酸鈉、硝酸鉀、氯化銨、尿素等量替換基礎發酵培養基中的胰蛋白胨，以基礎發酵培養基作對照，測定不同氮源的發酵無菌液對人參銹腐病菌抑菌活性的影響，抑菌活性大小和菌量測定方法同“1.2.3”節。

1.2.5 無機鹽對發酵液抑菌活性的影響 在基礎發酵培養基中碳源含量、氮源含量和其他培養條件不變的情況下，用硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸鋅、磷酸二氫鉀等量替換培養基中的碳酸鈣，以基礎發酵培養基作對照，測定不同無機鹽對人參銹腐病菌抑菌活性的影響，抑菌活性大小和菌量測定方法同“1.2.3”節。

1.2.6 均勻設計試驗 在確定主要碳、氮源的基礎上，對葡萄糖、牛肉膏、酵母粉、磷酸氫二鉀進行單因子試驗，采用不同濃度梯度（葡萄糖0～2 g，依次增加0.4 g；酵母粉0～0.1 g，依次增加0.02 g；磷酸氫二鉀0.1～0.2 g，依次增加0.02 g；牛肉膏1.5～2.5 g，依次增加0.2 g）。本研究采用DPS 7.05數據處理軟件進行統計分析，在以上試驗的基礎上選擇均勻設計法[14-15] U46的均勻設計表，用均勻設計使用表設計方案進行了多水平試驗，并結合偏最小二乘回歸分析[16]對其營養條件進行了優化。

2 結果與分析

2.1 不同培養條件對Y-S-Y12菌株發酵的影響

2.1.1 不同培養時間對Y-S-Y12菌株發酵的影響 隨著培養天數的增加，D值和抑菌率均有增加的趨勢，其中培養 3 d 時D值和抑菌率達到了高峰，隨后D值和抑菌率均有下降趨勢（表1）。結果表明，Y-S-Y12菌株的最佳發酵時間為3 d。

2.1.2 不同溫度處理對Y-S-Y12菌株發酵的影響 隨著溫度的增加，Y-S-Y12菌株的D值和抑菌率均有增加的趨勢。當培養溫度為28 ℃時D值最高，其次為33 ℃時的D值；培養溫度為33 ℃時的抑菌率最高，其次為28 ℃時的抑菌率。之后隨著溫度的增高D值和抑菌率均有下降的趨勢（表2）。結果表明，Y-S-Y12菌株的最佳發酵溫度為28～33 ℃。

2.1.3 不同轉速處理對Y-S-Y12菌株發酵的影響 隨著轉速的增加，Y-S-Y12菌株的D值和抑菌率均有增加的趨勢。當轉速為150 r/min時D值和抑菌率達到了高峰 （表3）。結果表明，Y-S-Y12菌株最佳發酵轉速為 150 r/min。

2.1.4 不同裝液量處理對Y-S-Y12菌株發酵濃縮液的影響 隨著裝液量的增加，Y-S-Y12的D值和抑菌率均有增加的趨勢。當裝液量為125 mL時D值和抑菌率達到了高峰，其次是100 mL的D值和抑菌率（表4）。結果表明，Y-S-Y12 菌株最佳發酵裝液量為125 mL。

2.1.5 不同pH值處理對Y-S-Y12菌株發酵的影響 隨著pH值的增加，Y-S-Y12的D值和抑菌率均有增加的趨勢。當pH值=6時D值和抑菌率達到了高峰，之后隨著pH值的增加D值和抑菌率有下降趨勢（表5）。結果表明，Y-S-Y12 菌株最佳發酵pH值為6。

2.1.6 不同培養基處理對Y-S-Y12菌株發酵的影響 在NA培養基上Y-S-Y12菌株的D值和抑菌率最高，其次為KB培養基和LB培養基上的D值和抑菌率（表6）。結果表明，Y-S-Y12菌株在NA培養基上發酵較好。

2.2 不同營養條件對Y-S-Y12菌株發酵的影響

不同碳源對Y-S-Y12菌株發酵的影響較大。其中以葡萄糖為碳源時的D值和抑菌率最高，其次為蔗糖，再次為麥芽糖（表7）。結果表明，Y-S-Y12菌株最佳發酵碳源為葡萄糖。

不同氮源對Y-S-Y12菌株發酵的影響較大。其中以牛肉膏為氮源時的D值和抑菌率最高，其次為胰蛋白胨，再次為硝酸鈉（表8）。結果表明，Y-S-Y12菌株最佳發酵氮源為牛肉膏。

不同無機鹽對Y-S-Y12菌株發酵的影響較大。其中磷酸氫二鉀為無機鹽時的D值和抑菌率最高，其次為硫酸鎂和硫酸鐵，再次為碳酸鈣（表9）。結果表明，Y-S-Y12菌株最佳發酵無機鹽為磷酸氫二鉀。

2.3 碳、氮源單因素試驗和均勻設計法優化

均勻設計方案及試驗結果見表10。采用偏最小二乘回歸[CM（25]法對試驗結果進行回歸建模分析，得到如下二次多項式回

3 結論

Y-S-Y12菌株的單因素培養條件優化結果表明，培養時間為 3 d，培養溫度為28～33 ℃，轉速為150 r/min，裝液量為 125 mL（培養容器的容量為250 mL），初始pH值為6時的發酵效果最好；供試培養基中Y-S-Y12菌株在NA培養基中的發酵效果最佳。

通過不同碳源、氮源及無機鹽對Y-S-Y12菌株發酵的影響研究，以葡萄糖為碳源，牛肉膏為氮源，磷酸氫二鉀為無機鹽時的發酵效果最好。進一步使用均勻設計法尋找最佳培養基配方，結果表明，最優配方為1.20 g葡萄糖、3.10 g酵母粉、2.00 g磷酸氫二鉀、24.86 g牛肉膏，此時抑菌率為51.10%。

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