正交試驗設計法篩選印度塊菌液體培養基

馬欣燕+王國正+郭成金

摘要： 為篩選出印度塊菌（Tuber indicum）最適用的液體培養基，以印度塊菌菌絲體生物量為測量指標，采用L9（34）正交試驗方法對各配比的印度塊菌液體培養基進行研究。結果表明，印度塊菌最適液體培養基為20.00 g/L葡萄糖，15.00 g/L麥芽糖，1.50 g/L蛋白胨，2.50 g/L酵母浸粉，3.00 g/L KH2PO4，1.50 g/L MgSO4·7H2O，0.008 g/L維生素B1，pH值自然。25 ℃、120 r/min搖瓶培養120 h，其菌絲生物量干質量可達9.58 g/L。

關鍵詞： 印度塊菌；正交試驗；液體培養基；菌絲體；生物量

中圖分類號： S646.04 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0200-03

印度塊菌（Tuber indicum）屬子囊菌門（Ascomycota）盤菌綱（Pezizomycetes）盤菌目（Pezizales）塊菌科（Tuberaceae）塊菌屬（Tubera）[1]，是一種極為珍貴的菌根食用菌。印度塊菌主要分布在中國西南地區的云南省、四川省；云南省主要分布在昆明、曲靖、麗江、玉溪、保山、楚雄州、大理州、迪慶州、怒江州等地，四川省主要分布在攀枝花地區、涼山州[2]。印度塊菌常生長于云南松、華山松林及高山櫟下[3]。據報道，我國出產的印度塊菌所含糖、蛋白質、氨基酸、礦物質、維生素等成分很高，可與黑孢塊菌（Tuber melonosporum）相媲美[4]。此外，印度塊菌所含有的活性成分如塊菌多糖、α-雄烷醇等具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤及調節女性月經等功效[5-9]。

至今，國內外對印度塊菌的研究報道主要是在活性物質特性、提取純化[5-10]、人工栽培[11-12]等方面，未見印度塊菌液體培養基篩選方面的相關研究報道。筆者試圖通過碳、氮源單因素試驗并結合L9（34）正交試驗方法的研究，篩選出印度塊菌最適液體培養基，旨在為印度塊菌菌種生產、原生質體融合、紫外誘變育種以及液體發酵活性物質提取等研究提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

印度塊菌（Tuber indicum），由天津師范大學生命科學學院蕈菌研究室提供。

1.2 試驗試劑

葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蛋白胨、酵母浸粉、KH2PO4、 MgSO4·7H2O、維生素B1、瓊脂，均為分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 試驗儀器

YXQG02手提式壓力蒸汽消毒器，山東新華醫療器械廠；Sartorius BS/BT系列電子天平，德國賽多利斯科學儀器有限公司；SW-CJ-2超凈工作臺，上海錦屏儀器儀表有限公司；SPX型生化培養箱，北京市永光明醫療儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；101型電熱鼓風干燥箱，北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.4 培養基

1.4.1 活化培養基 200.00 g/L馬鈴薯（浸提液）、20.00 g/L 葡萄糖、3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O、0.004 g/L維生素B1、20.00 g/L瓊脂。

1.4.2 碳源初選培養基 分別以20.00 g/L葡萄糖、20.00 g/L 蔗糖、20.00 g/L麥芽糖、200.00 g/L馬鈴薯（浸提液）、2.00 g/L乳糖為供試碳源。其他成分為：2.00 g/L蛋白胨、3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O、0.004 g/L維生素B1，pH值自然。

1.4.3 氮源初選培養基 分別以2.00 g/L蛋白胨、2.00 g/L酵母浸粉、20.00 g/L麥麩（取浸提液）、2.00 g/L硫酸銨、2.00 g/L 硝酸銨為供試氮源。其他成分為：20.00 g/L葡萄糖、3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O、0.004 g/L維生素B1，pH值自然。

1.5 試驗方法

1.5.1 菌種活化與提純復壯 在無菌條件下，將菌種用活化培養基提前5 d活化，挑取強壯菌絲尖端，接種于斜面培養基上復壯，于25 ℃培養5～7 d備用。

1.5.2 轉接液體培養基 采用100 mL錐形瓶，裝液量為 50 mL，每瓶接種5塊0.5 cm2菌塊，于25 ℃靜置培養48 h，然后于25 ℃、120 r/min條件下搖瓶培養120 h，每個水平設3組重復。

1.5.3 菌絲體干質量測量 濾紙分別編號后置電子天平上稱質量，后將培養120 h的印度塊菌菌絲體培養物分別用相對應編號濾紙抽濾，蒸餾水洗滌3次后，置于80 ℃烘箱烘干至恒質量、稱量。

1.5.4 碳源、氮源培養基正交試驗 依據碳、氮源單因素試驗結果，以菌絲體干質量均值為標準，分別選擇2個均值較高的碳源、氮源，按L9（34）設計4因素3水平正交試驗進行復選，與3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O、0.004 g/L維生素B1 組成9組試驗配方，正交試驗因素與水平設計見表1。

1.5.5 無機鹽及維生素水平試驗 根據混合碳、氮源正交試驗結果，選出最佳碳源、氮源組合為基礎培養基，再向其中添加不同濃度配比的KH2PO4 、 MgSO4·7H2O和維生素B1，具體處理見表2。

2 結果與分析

2.1 不同碳素營養對印度塊菌菌絲體生長的影響

碳源是蕈菌培養基的主要營養成分之一，也是蕈菌菌絲細胞碳架結構、生長以及代謝的重要能量物質來源[13]。一些蕈菌相關研究表明，碳源主要對細胞生長和活性生物成分的合成有較大影響[14-15]。從表3可以看出，印度塊菌對5種碳源均有不同程度的利用，以菌絲生物量為標準來看，其中麥芽糖的利用率最高，葡萄糖次之，乳糖最差。由表4可見，統計學方差分析F值為11.242，F>F4，10，0.01=5.994[16]，表明不同碳源培養基對印度塊菌菌絲體生物量的影響在α=0.01水平上差異顯著，依據印度塊菌菌絲生物量大小，選擇麥芽糖、葡萄糖進行碳氮源正交試驗。

2.2 不同氮素營養對印度塊菌菌絲體生長的影響

氮源是食用菌細胞合成蛋白質和核酸必不可少的主要原料[17]。經前人試驗表明，蕈菌對有機氮和無機氮均可利用且對前者的利用率高于后者[18-19]。為了全面詳細地研究氮源對印度塊菌菌絲體的影響，筆者對有機氮和無機氮的使用都進行了探索。試驗結果表明，氮源對印度塊菌菌絲體生物量的影響有一定差異。以酵母浸粉為氮源的培養基生物量最大，以硝酸銨為氮源的培養基生物量最小。有機氮源中以酵母浸粉為氮源的培養基菌絲體生物量最高，蛋白胨次之，麥麩最差；而無機氮源中以硫酸銨為氮源的培養基菌絲體生物量要高于硝酸銨氮源的。一般的NH4+鹽比NO3-鹽優先被利用，NO3-進入細胞后需要還原成NH4+后才能參與細胞物質合成[20]。方差分析（表5、表6）表明，印度塊菌對氮源的利用存在顯著差異，且酵母浸粉、蛋白胨要優于其他3種氮源，因此選擇酵母浸粉、蛋白胨進行碳氮源正交試驗。

2.3 正交試驗結果與分析

由正交試驗結果和極差分析（表7）可知，影響印度塊菌菌絲生物量的大小關系為A>B>C>D。極差越大，各因素在水平變動時對生物量變化的影響就越大[21-22]。因此可知，葡萄糖是影響印度塊菌菌絲生物量的主要因素。k1、k2、k3之間的差異是由因素取不同水平所引起，且k值相對較大的因素水平是較好的培養條件[23]。依據水平之間k值大小可知，印度塊菌最佳液體培養基組合為A3B3C3D1，即20.00 g/L葡萄糖，15.00 g/L麥芽糖，1.50 g/L蛋白胨，2.50 g/L酵母浸粉。

2.4 不同無機鹽和維生素B1濃度對印度塊菌菌絲生物量的影響

無機鹽中礦質元素、維生素B1的存在及濃度均對新陳代謝過程起著重要作用[13]，兩者比例大小會對于菌絲生長起到促進或延緩的作用[23-24]。為了完善培養基，使其營養均衡，對無機鹽、維生素B1的濃度也進行了篩選，結果見表8。表9方差分析結果表明，不同處理間差異極顯著。其中無機鹽、維生素B1濃度的最佳組合為處理3，即 3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O、0.008 g/L維生素B1。

通過對最終所獲得的印度塊菌最佳液體培養基配方進行3次重復試驗，結果所得菌絲平均生物量干質量為9.58 g/L。

2.5 搖瓶培養前后印度塊菌菌絲量和形態對比

以最終獲得的印度塊菌最佳液體培養基配方進行驗證試驗，從圖1、圖2可以看出，印度塊菌在搖瓶培養前后菌絲量對比差異明顯。搖瓶培養前，靜置48 h后的培養基清澈透亮，印度塊菌菌片漂于培養上或沉于瓶底，菌片上有絨狀、極短的新生菌絲（圖1）。搖瓶培養120 h后，培養基渾濁，可觀察到有大小不一的菌絲球和絮狀菌絲，瓶壁內側有白色絨狀氣生菌絲（圖2）。

3 結論

通過單因素試驗、正交試驗相結合的研究方法得出印度

塊菌最適液體培養基，為今后印度塊菌液體發酵活性物質提取提供理論依據，從而更加有效地利用這一珍貴的蕈菌資源。最終獲得的印度塊菌最適液體培養基配方：20.00 g/L葡萄糖，15.00 g/L麥芽糖，1.50 g/L蛋白胨，2.50 g/L酵母浸粉，3.00 g/L KH2PO4、1.50 g/L MgSO4·7H2O，0.008 g/L維生素B1，pH值自然。25 ℃、120 r/min培養120 h，其生物量可達9.58 g/L。

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