不同產地廣東紫珠藥材苯乙醇苷類成分含量與抗氧化能力的相關性

聶韡+房海靈+鄧紹勇+朱培林

摘要： 采用超聲提取廣東紫珠中的連翹酯苷B和金石蠶苷，用HPLC法測定其含量，并考察其與抗氧化活性的相關性。色譜柱為sunfire C18 4.6 mm×250 mm色譜柱；流動相為乙腈：水（含0.1%甲酸）的溶液（18 ∶ 82）；檢測波長為332 nm。抗氧化活性采用DPPH法和鐵氰化鉀還原法測定。測定結果，廣東紫珠藥材中連翹酯苷B和金石蠶苷含量最高的分別來自江西武寧和萍鄉蘆溪，相關性分析結果表明，連翹酯苷B和金石蠶苷含量與廣東紫珠抗氧化能力均有一定的正相關性。表明不同產地廣東紫珠藥材中連翹酯苷B和金石蠶苷的含量有顯著差異；苯乙醇苷類成分為廣東紫珠中主要的抗氧化成分，與自由基清除率和總還原力呈正相關。

關鍵詞： 廣東紫珠；連翹酯苷B；金石蠶苷；抗氧化活性

中圖分類號： R284.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0273-03

廣東紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun.）為馬鞭草科紫珠屬多年生落葉小灌木，莖枝以及葉入藥，收錄于2010版國家藥典，具有收斂止血、清熱解毒等作用[1]。廣東紫珠以地上部位入藥，其中的苯乙醇苷類成分被認為是其主要化學成分，目前，研究者從中分離到10余種該類化合物[2-3]。相關研究表明，植物中的苯乙醇苷類成分具有較好的抗氧化活性[4]。相關學者對廣東紫珠的抗氧化作用進行了初步研究。結果表明，廣東紫珠的各極性部位均有不同程度清除 DPPH·、OH·的能力[5]。目前，對廣東紫珠藥材的抗氧化活性研究還較少，苯乙醇苷類具體成分與抗氧化能力之間的相關性研究還未見報道。因此，本試驗首先利用HPLC法測定了12個不同產地的廣東紫珠中連翹酯苷B和金石蠶苷2種苯乙醇苷類成分，同時測定了12個不同產地廣東紫珠的DPPH清除率和總還原力，并對二者數據進行了相關性分析，對廣東紫珠藥材的抗氧化作用進行研究，以期為更好地綜合開發利用廣東紫珠資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，紫外檢測器2489，美國Waters公司生產；UV-752紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司生產；CP214型分析天平，奧豪斯儀器有限公司生產；超聲清洗器，潔康超聲波有限公司生產；超聲波功率 120 W，頻率40 kHz；RE-52旋轉蒸發器，上海亞榮公司生產。

1.2 藥品

2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）購于西格瑪公司上海辦事處；連翹酯苷B和金石蠶苷對照品購自南京澤朗醫藥有限公司，純度經檢驗大于98%；乙腈為色譜純鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醇、甲酸等均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

1.3 材料

廣東紫珠藥材采自12個不同產地，藥材來源見表1，經江西省林業科學院鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物廣東紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun.）的地上部分。

1.4 方法

1.4.1 樣品溶液的制備

1.4.1.1 對照品溶液的制備 精確稱取連翹酯苷和金石蠶苷對照品各5.00 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，精確量取各標準品溶液1 mL，混勻，制得混合標準品溶液，進樣前用微孔濾膜過濾，去雜質，備用。

1.4.1.2 樣品溶液的制備 取干燥廣東紫珠藥材，粉碎，過50目篩，精確稱定2 g，置具塞錐形瓶中，加入50%乙醇20 mL，36 ℃超聲提取30 min，提取2次，靜置，過濾，合并2次濾液，并濃縮定容至20 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.4.2 廣東紫珠中苯乙醇苷成分含量測定 色譜條件：色譜柱為sunfire C18 4.6 mm×250 mm色譜柱；流動相為乙腈 ∶ 水（含0.1%甲酸）為18 ∶ 82；檢測波長為332 nm；流速為 1 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量10 μL。

1.4.3 抗氧化活性測定方法

1.4.3.1 自由基清除活性測定方法（DPPH法）[6] DPPH用無水乙醇配制成0.039 4 mg/mL的溶液，置于棕色瓶中備用。取各廣東紫珠藥材提取液（按照“1.4.1.2”節的方法制備，并稀釋至濃度為0.1 mg/mL）3 mL，加入3 mL DPPH 標準液，于517 nm波長處測得吸光值Di；以乙醇代替樣品溶液做空白試驗，在 517 nm處測吸光值D0；另取3 mL溶液加3 mL 乙醇測得吸光度為Dj。根據以上數據算出清除率：

清除率=[1-（Di-Dj）/D0]×100%。

1.4.3.2 總還原力測定法（鐵氰化鉀法）[7] 在2.5 mL pH值6.6磷酸緩沖溶液中加入1 mL廣東紫珠樣品溶液（按照“1.4.1.2”節的方法制備，并稀釋至濃度為2.5 mg/mL）、2.5 mL 1% 鐵氰化鉀，混合物在 50 ℃恒溫條件下，加熱 20 min。急速冷卻，加2.5 mL 10%三氯乙酸，混勻后以3 000 r/min 離心10 min。取上層清液 2.5 mL，加2.5 mL蒸餾水再加0.5 mL 0.1% FeCl3，混合均勻，靜置10 min 后，在700 nm處測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 廣東紫珠中連翹酯苷B和金石蠶苷含量測定方法學考察

2.1.1 標準曲線的測定 分別精確稱取連翹酯苷B、金石蠶苷各5 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得對照品溶液。分別精確量取1 mL，混合，得混合對照品儲備液。注入高效液相色譜儀，進樣體積分別為1、4、8、12、16、20 μL，測定連翹酯苷B、金石蠶苷的峰面積，分別以連翹酯苷B、金石蠶苷的量（μg）為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，計算回歸方程，得到連翹酯苷B的回歸方程為：y=886 531x+284 290，r=0.995 1；金石蠶苷的回歸方程為：y=982 413x+371 749，r=0.9995。結果表明，連翹酯苷B和金石蠶苷在0.25～5.0 μg 范圍內線性關系均良好。標準品及樣品HPLC圖見圖1、圖2。

2.1.2 精密度 取2種對照品的混合溶液，注入液相色譜柱，進樣量10 μL，重復進樣6次，測定2種標準品峰面積值，計算RSD值分別為連翹酯苷B 0.89%，金石蠶苷0.41%，結果表明，本測定方法有較好的精密度。

2.1.3 穩定性 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 各進樣1次，測定連翹酯苷B、金石蠶苷的峰面積值，計算RSD值分別為連翹酯苷B 1.86%，金石蠶苷1.51%，結果表明，樣品在24 h內有較好的穩定性。

2.1.4 重復性 稱取廣東紫珠藥材粉末0.5 g，平行6份，按“1.4.1.2”節的方法制備6份供試品溶液，各取10 μL分別注入高效液相色譜儀，測定連翹酯苷B、金石蠶苷的峰面積值，計算RSD值分別為連翹酯苷B 0.89%，金石蠶苷0.93%。結果表明，本測定方法有較好的重復性。

2.1.5 加樣回收率 采用加樣回收法測定回收率。稱取廣東紫珠藥材粉末6份，每份約0.5 g，精確稱定，分別加入對照品粉末各5 mg，按“1.4.1.2”節的方法制備6份供試品溶液。測定連翹酯苷B、金石蠶苷的含量，計算求得連翹酯苷B的平均回收率為98.03%，RSD為0.66%；金石蠶苷的平均回收率為98.15%，RSD為0.51%。

2.2 樣品含量測定

取各產地樣品，按照“1.4.1.2”節的方法進行樣品溶液制備，并按照“1.4.2”節的方法測定不同產地廣東紫珠藥材中連翹酯苷B和金石蠶苷的含量，結果見表2。來自12個不同產地的廣東紫珠，其連翹酯苷B、金石蠶苷含量均符合2010版《中國藥典》二者之和不得低于0.5%的要求，但各產地之間含量差異較為顯著，其中來自蘆溪及武寧的廣東紫珠樣品的連翹酯苷B、金石蠶苷含量明顯高于其他產地，而余江、安遠、廣東南雄產地的廣東紫珠中連翹酯苷B、金石蠶苷的含量遠遠低于其他各產地。

2.3 樣品抗氧化活性測定

取各產地樣品，按照“1.4.3”節的方法測定不同產地廣東紫珠藥材的抗氧化活性。由表3可見，各產地的廣東紫珠樣品抗氧化活性差別很大，來自廣西桂林、江西宜春、江西九江武寧、江西萍鄉萬寒寨、江西萍鄉蘆溪的廣東紫珠藥材樣品清除自由基能力較強，江西余江產的廣東紫珠藥材樣品清除自由基能力最弱。廣西桂林、江西宜春、江西萍鄉萬寒寨、江西井岡山、江西九江武寧產的廣東紫珠藥材總還原力較強，江西余江產的廣東紫珠藥材樣品總還原力最弱。

2.4 廣東紫珠藥材中苯乙醇苷含量與抗氧化活性的雙變量相關性分析

采用SPSS 19.0軟件進行雙變量相關性分析，分析不同產地廣東紫珠藥材樣品連翹酯苷B和金石蠶苷的含量與抗氧化活性試驗結果的pearson相關系數，結果見表4，雙變量相關分析是研究變量之間密切程度的一種統計方法，2個因素之間的關系越密切，其相關系數越大。結果表明，連翹酯苷B和金石蠶苷與DPPH清除自由基能力具有顯著的正相關性；與總還原力具有正相關。雙變量相關分析結果表明，廣東紫珠中苯乙醇苷類成分的含量與抗氧化活性具有明顯的相關性，但是抗氧化活性是不同物質協同作用的結果，僅僅通過簡單的相關分析不能準確、全面地反映二者之間的關系，在今后研究中還需進行進一步分析。

3 討論

流動相的考察。分別考察了甲醇-水、乙腈-水2種基本流動相系統，結果表明，乙腈-水為流動相系統的色譜峰峰形較好，且考慮到連翹酯苷B和金石蠶苷2種化學成分含有酚羥基，略顯酸性，因此，嘗試在流動相中加入少許酸以調節峰形。分別試驗了0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.05%三氟乙酸、0.2% 磷酸，結果表明，流動相中加入少許酸可顯著調節色譜峰峰形，且4種酸的效果基本相似，但考慮到磷酸黏度較大，對儀器和柱子損傷較大；三氟乙酸價格較貴；且乙酸相比甲酸沸點高，不易揮發，因此選擇乙腈-水（0.1%甲酸）為最佳流動相。最后確定HPLC色譜條件為：以乙腈-水（0.1%甲酸）為流動相系統；柱溫：25 ℃；檢測波長：332 nm；流速：1 mL/min。

眾多文獻報道，苯乙醇苷類成分具有較強的抗氧化活性，而廣東紫珠藥材中主要的化學成分也是苯乙醇苷類成分，因此理論上廣東紫珠藥材也應該是一種具有較強抗氧化活性的中藥材。本研究結果表明，廣東紫珠藥材具有顯著的清除自由基作用，總還原力也較強；相關性分析結果也顯示抗氧化活性和苯乙醇苷類成分的含量具有正相關性。廣東紫珠在抗氧化方面會有很好的應用前景。本研究結果也為廣東紫珠藥材抗氧化活性的深入研究提供了理論基礎。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M]. 2010版. 北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[2]郭 文，付輝政，周國平，等. 廣東紫珠正丁醇部位化學成分分析[J]. 中國實驗方劑學雜志，2015，21（3）：30-33.

[3]胡 曉，李 麗，楊義芳，等. 廣東紫珠中咖啡酰基苯乙醇苷類化合物[J]. 中國中藥雜志，2014，39（9）：1630-1634.

[4]顏 芳，曾光堯，譚健兵，等. 植物中苯乙醇苷類化合物研究進展[J]. 中南藥學，2013，11（5）：358-362.

[5]鄭欽方. 廣東紫珠藥材質量及抗氧化與燙傷愈合活性研究[D]. 長沙：湖南農業大學，2012.

[6]周 瑩，劉廣鋒，馮 娟，等. 何首烏3種組分的提取及其清除DPPH自由基作用的研究[J]. 廣東藥學院學報，2014，30（3）：301-304.

[7]吳海虹，玄國東，劉春泉，等. 肉蓯蓉苯乙醇苷的純化及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學，2008，29（6）：190-193.