熱處理對棗果肉中纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶活性及底物含量的影響

崔升+張娜+許建+于寧+韋玉龍+黃雪嬌+李煥榮

摘要： 為獲得棗最佳的工藝參數(shù)，以山東冬棗為原料，通過熱處理研究冬棗中纖維素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的變化及纖維素、果膠的保留量，利用響應面分析法設計3因素3水平的優(yōu)化試驗，結果表明，熱處理時間 4 min、處理溫度93 ℃、投料量27 g/L為最佳的熱處理條件，此條件下纖維素酶（Cx）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）被滅活，纖維素和果膠保留量分別為0.647 0 D620 nm/g和0.085 9%。

關鍵詞： 冬棗；熱處理；酶活；果膠；纖維素酶；多聚半乳糖醛酸酶

中圖分類號： S665.101；TS201.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0279-05

冬棗別稱蘋果棗，含有豐富的維生素A、維生素E及鉀、鈉、鐵、銅等多種礦物質(zhì)元素。鮮冬棗皮薄、肉脆、質(zhì)優(yōu)、味甘的特異品質(zhì)，在古代被欽定為“貢品”[1]。果實質(zhì)地是構成果實品質(zhì)的重要因素，而采后冬棗很容易軟化、腐爛，致使各種營養(yǎng)成分大量喪失。目前研究認為，果實的軟化是由構成細胞間層及細胞壁的果膠降解所致，而果膠的分解與多聚半乳糖醛酸酶（PG）的活性有密切的關系[2-4]。與此同時，纖維素的降解也會促進果實的軟化，而調(diào)節(jié)纖維素降解的水解酶主要是纖維素酶（Cx）[4]，鱷梨的軟化就是纖維素酶在起作用[5]。本試驗通過對冬棗進行熱處理，分析其多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶活性及果膠、纖維素含量的變化，以尋求最佳的熱處理條件，使PG 和Cx這2種酶被滅活的同時果膠和纖維素保留量最高，為果蔬熱處理技術進一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

冬棗，產(chǎn)自山東沾化。選擇著色度為20%～60%的半紅棗，手工采摘以防造成機械損傷；0～4 ℃保藏，待用。

0.15%咔唑、100 μg/mL半乳糖醛酸標準液、濃硫酸（分析純）、50 mmol/L pH值為5.5的醋酸鈉緩沖液、1.8 mol/L NaCl、1%多聚半乳糖醛酸溶液、3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑、50 mmol/L pH值為5.0的檸檬酸緩沖液、1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液。

TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器責任有限公司生產(chǎn)；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；TGL-16aR型冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠生產(chǎn)；含研缽組織搗碎機；FE20K Plus型pH計，梅特勒-托利儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程 原料選擇→揀選→清洗→切片→熱處理→熱風干燥→打粉→包裝。

1.2.2 操作要點 揀選無機械損傷、無病蟲害、著色度為20%～60%且大小均勻的紅棗，用去孔器將紅棗的核去掉；順著核孔垂直切片，棗片厚度為3 mm左右；將定量的棗片裝入紗布網(wǎng)中，確保網(wǎng)內(nèi)空間足夠大，避免棗片上浮于水面；將紗布網(wǎng)放入設定并達到溫度的水浴鍋中，水浴鍋中水量按料液比設定；達到處理時間后迅速取出，并用液氮冷凍，低溫存放備用。

1.2.3 熱處理單因素試驗設計

1.2.3.1 料液比的選擇 以Cx、PG酶活性和纖維素、果膠保留量為指標，處理溫度為85 ℃、時間為4 min，液料比（mL ∶ g）分別為20 ∶ 1、40 ∶ 1、60 ∶ 1、80 ∶ 1、100 ∶ 1。

1.2.3.2 處理時間的選擇 以Cx、PG酶活性和纖維素、果膠保留量為指標，處理溫度為85 ℃、液料比為40 mL ∶ 1 g，處理時間分別為1、2、3、4、5 min。

1.2.3.3 處理溫度的選擇 以Cx、PG酶活性和纖維素、果膠保留量為指標，處理時間為4 min、液料比為40 mL ∶ 1 g，處理溫度分別為75、80、85、90、95 ℃。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上，選取處理溫度、處理時間、料液比3因素為自變量（表1），分別以Cx活性、PG活性、纖維素含量、果膠含量為響應值，根據(jù)Design-Expert 8.0.5b軟件Box-Behnken的試驗設計方法，設計3因素3水平共17個試驗點的響應面分析試驗，其中12組是析因試驗，5組是中心試驗。

1.2.5 測定指標及方法 果膠含量、Cx酶活性和PG酶活性的測定參照曹建康等的方法[6]；纖維素含量測定參照李合生等的方法[7-8]，并進行部分修改。準確稱量2 g棗果置于冰水浴的燒杯中，用60 mL 60%硫酸溶液消化30 min；轉(zhuǎn)入100 mL 的容量瓶中，用同一濃度硫酸定容至刻度線；用布氏漏斗過濾，取溶液5 mL用蒸餾水定容至100 mL，搖勻；取溶液2 mL于比色管中，加0.5 mL 2%蒽酮試劑，再緩慢加入 5 mL 濃硫酸，搖勻；靜置12 min，波長620 nm下測吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Design-Expert 8.0.5b數(shù)據(jù)處理軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對冬棗片熱處理的效果 由圖1可見，隨料液比的增大，纖維素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）的活性越高；液料比為20 mL ∶ 1 g和40 mL ∶ 1 g時，2種酶的活性變化不大，說明此時棗片的添加量基本不會影響酶活性的變化；隨料液比的增大，纖維素和果膠保留量下降明顯，這可能是因為料液比增加使水溫下降，致使酶能夠長時間保持較高的活性，促進了纖維素和果膠的分解，而液料比為20 mL ∶ 1 g和40 mL ∶ 1 g時，酶的活性降低很快，故而纖維素和果膠保留量較高?？紤]實際操作和人力、物力消耗，選擇液料比為40 mL ∶ 1 g較合適。

2.1.2 熱處理時間對冬棗片的影響效果 由圖2可見，隨熱處理時間的延長，酶活性總體呈下降趨勢，相應的纖維素和果膠的保留量也逐漸減少，5 min時保留量下降明顯，這可能是纖維素和果膠溶解到熱水中的緣故。因此，選擇熱處理時間為4 min較合適。

2.1.3 熱處理溫度對冬棗片的影響效果 由圖3可見，熱處理溫度越高，酶的活性越低，75～90 ℃酶活性急劇下降，90～95 ℃酶活變化趨于平緩；90 ℃處理時纖維素和果膠的保留量最高，95 ℃時有所降低，這可能是因為高溫促進纖維素和果膠熱分解的發(fā)生[9]。因此，選擇處理溫度為90 ℃較合適。

2.2 響應面分析

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗 利用軟件對試驗結果（表2）進行擬合，得到熱處理時間（A）、熱處理溫度（B）、料液比（C）分別與纖維素酶活性、果膠酶活性、纖維素含量、果膠含量的二次多項回歸方程為：Cx酶活=0.037-0.039A-0.22B+0032C-0.097AB+0.039AC-0.018BC+0.072A2+0.19B2+0.037C2；PG酶活=0.037-0.033A-0.24B+0.085C-011AB+0.05AC-0.074AB+0.082A2+0.21B2-0.032C2；纖維素保留量=0.64-0.000 125A+0.022B-0.017C-0001 5AB+0.013AC+0.005 25BC-0.008 45A2-0.024B2-0.013C2；果膠保留量=0.085+0.000 0625A+0.003 125B-0001 888C+0.000 375AB+0.001 35AC+0.001 075BC-0001 785A2-0.002 71B2-0.001 085C2。

統(tǒng)計分析表明，回歸模型均顯著（P<0.05），失擬項不顯著（P>0.05），這說明方程擬合性較好，可用回歸方程來預測實際的試驗結果（表3至表6）；纖維素酶活性、果膠酶活性、纖維素含量、果膠含量的二次多項回歸方程決定系數(shù)R2分別為0.934 8、0.949 5、0.975 7、0.951 7，不良適配度僅分別為0.065 2、0.050 5、0.024 3、0.048 3，這說明響應值與自變量之間的回歸系數(shù)呈現(xiàn)較高比例，回歸線與回歸數(shù)據(jù)之間適配度較好；信噪比分別為10.349、11.760、18.986、11.846，均大于4，這說明4個模型均可以準確反映試驗結果。由表3可見，處理溫度、處理溫度和時間的交互項、處理溫度的二次項對Cx酶活性的影響顯著，P值分別為0.000 1、0.047 1、0.002 0，均小于0.05；由表4可見，處理溫度、處理溫度和時間的交互項、處理溫度的二次項對PG酶活性的影響顯著，P值分別為<0.000 1、0.027 9、0.001 0，均小于0.05；由表5可見，處理溫度、處理時間和料液比的交互項、處理溫度的二次項對纖維素保留量影響顯著，P值分別為<0.000 1、0.003 5、<0.000 1，均小于0.05；由表6可見，處理溫度、料液比、處理時間和料液比的交互項、處理時間的二次項、處理溫度的二次項對果膠保留量影響顯著，P值分別為0.000 1、0.002 1、0.046 9、0.013 7、0.001 6，均小于0.05。

2.2.2 各因素交互作用的影響 采用Design Expert 8.0.5 b軟件，按照回歸方程式繪制等高線圖和響應面圖（圖4至圖7）。從等高線可以觀察交互影響效應的強弱，圓形表示2個因素交互影響作用不顯著，而橢圓形則表示2個因素交互影響作用顯著。響應面圖是依照響應值對各試驗因子構成的三圍空間曲面圖形，可以形象地看出各參數(shù)間的相互作用及最佳參數(shù)，當特征值均為正值時，響應面圖表現(xiàn)為山谷形曲面，存在最小值，當特征值均為負值時，響應面圖表現(xiàn)為山丘形曲面，存在最大值，當特征值有正值、有負值時，響應面圖表現(xiàn)為鞍馬形曲面，無極值存在，從經(jīng)濟角度考慮，響應面0點水平的處理條件較為合適。

通過等高線圖可見，熱處理時間和熱處理溫度2個因素的交互作用對Cx酶和PG酶活性影響顯著，熱處理時間和料液比2個因素的交互作用對纖維素和果膠保留量影響顯著；從響應面圖可見，各因素水平過高或過低，對考察指標均有不利影響，處理溫度高、處理時間長能夠很好地將酶滅活，但處理溫度升到95 ℃，其果膠和纖維素保留量有下降的趨勢（圖4至圖7），這可能是高溫使果膠和纖維素發(fā)生熱分解，而時間越長溶出量越大，從而導致保留量下降。

2.2.3 反應條件優(yōu)化及模型驗證 通過數(shù)學模型及響應面分析得出，棗熱處理的最佳工藝條件為：處理時間3.80 min、處理溫度92.12 ℃、料液比27.42 g/L，此條件下PG酶和Cx酶被滅活，纖維素和果膠保留量分別為0.654 D620 nm/g、0.086 4%。為實際操作方便，將熱處理條件調(diào)整為：處理時間4 min、處理溫度93 ℃、料液比27 g/L，經(jīng)5次平行試驗發(fā)現(xiàn)，此條件下Cx酶和PG酶被完全滅活，纖維素和果膠保留量分別為0.647 D620 nm/g、0.085 9%，與預測值相差較小。

3 結論

試驗利用Design-Expert 8.0.5 b軟件設計響應面，優(yōu)化熱激處理工藝條件，并進行試驗驗證，得到棗最佳提取工藝條件為：處理時間4 min、處理溫度93 ℃、料液比27 g/L，此條件下Cx酶和PG酶被完全滅活，纖維素和果膠保留量分別為 0.647 D620 nm/g、0.085 9%，這可為相關生產(chǎn)加工提供理論參考和借鑒。

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