高體積分數CO2處理對柿果實褐變的影響

閔婷+鄭夢林+李陽+殷學仁+陳昆松+易陽+王宏勛

摘要： 澀柿果實采收后須經人工脫澀才能用于鮮食，其中高體積分數CO2脫澀處理應用最廣泛。經高體積分數CO2處理后，柿果實在貯藏過程中也會發生褐變。多酚氧化酶PPO作為酶促褐變最關鍵的基因，在各種果蔬中的研究較多，而關于PPO基因是否參與澀柿果實脫澀后褐變的研究尚未見報道。以“恭城水柿”為材料，經95% CO2處理2 d后切片，通過可溶性單寧含量測定、褐變程度觀察、PPO基因克隆與表達分析研究CO2處理對“恭城水柿”褐變的影響。結果表明，經95% CO2處理后，柿果實的可溶性單寧含量明顯下降，柿果實完成脫澀。脫澀后的柿鮮切片于20 ℃下放置12 h后發生明顯褐變。本研究克隆獲得PPO基因部分片段序列，聚類分析表明，該PPO基因與蘋果PPO基因較同源；基因表達分析顯示，該PPO基因在CO2處理后的鮮切柿片中的表達量比對照低，表明該PPO基因可能與柿子脫澀后的褐變無相關性。

關鍵詞： 恭城水柿；脫澀；褐變；PPO

中圖分類號： TS255.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0288-03

柿（Diospyros kaki）屬于柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros），起源于東亞，主要分布于中國、日本、韓國等東亞國家[1]。不同于其他水果，柿果實的獨特之處在于其能累積大量單寧，其中可溶性單寧可導致澀味。柿果實根據其自然脫澀的能力分為甜柿和澀柿。甜柿能在樹上自然完成脫澀，采收后可直接食用；澀柿果實成熟時可溶性單寧含量仍較高，采收后須經人工脫澀方能鮮食[2]。我國栽培的品種多為澀柿，澀柿的脫澀技術較為成熟，包括乙烯處理、CO2處理[3]、溫水浸泡、交替凍融[4]等，其中高體積分數CO2處理應用最為廣泛。然而，高體積分數CO2處理柿果實后，果實在貯藏過程中也會發生褐變，且處理時間越長則褐變程度越深[5]，使柿果實在貯藏和貨架期的果實品質下降。

褐變是果實品質劣變最明顯的特征之一，不僅影響果品的營養、外觀、風味，并已成為果蔬貯藏加工的主要障礙[6]。果蔬褐變多以酶促褐變為主，與酶促褐變密切相關的酶類主要為多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），多酚類物質在PPO的作用下氧化成醌，醌再聚合生成黑色或褐色的色素沉淀，組織表現為褐變。隨著分子生物學的發展，馬鈴薯[7]、梨[8]、甘薯[9]、蘑菇[10]、蓮藕[11]等植物的PPO基因相繼被克隆，而關于柿果實中PPO酶活性及其特性的報道較少。

以“恭城水柿”為材料，經95% CO2處理2 d后切片，通過可溶性單寧含量分析、褐變程度觀察、PPO基因克隆與表達分析研究CO2處理對“恭城水柿”褐變的影響，并進行PPO基因的克隆、進化樹分析、基因表達分析，以期闡明柿果實脫澀后褐變的生物學機制。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

供試“恭城水柿”購自廣西壯族自治區恭城縣商業果園。甲醇、沒食子酸、福林酚、NaCO3、NaCl、HCl、十六烷基三甲基溴化銨、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、LiCl、十二烷基硫酸鈉、氯仿、異戊醇、無水乙醇均購自國藥集團化學試劑有限公司。DEPC水、亞精胺、巰基乙醇均購自上海生工試劑公司。液氮購自湖北省武漢市明輝氣體有限公司。雙蒸水。

1.2 主要儀器

V-110D型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司），HH-S4型數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠），GL-20G-2型飛鴿牌離心機（上海安亭科學儀器廠），00101D型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），S2-93型自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠），DHG-9140A型電熱鼓風干燥器（上海一恒科學儀器有限公司），HYC-326A型醫用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司），DYCP-31DN型電泳儀（北京市六一儀器廠），CP214（C）型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司），PTT-A500型電子天平（福州華志科學儀器有限公司），IMS-20型雪科制冰機（常熟市雪科電器有限公司），凝膠成像儀（美國伯樂公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫澀處理 成熟“恭城水柿”果實自商業果園采收后，于2 d內運至實驗室。選擇成熟度相對一致、果形勻稱、大小中等、無機械損傷的果實進行相關采后試驗。將果實平均分為2組，每組約50個，一組經95% CO2處理2 d后轉貨架[12]；另一組作為對照，置于20 ℃下直至試驗結束。

1.3.2 切片處理 將脫澀試驗完成后的處理組和對照組果實去皮，并切片為3.0 cm×3.0 cm×0.3 cm大小，2組各切30片，置于20 ℃下12 h后拍照，液氮取樣用于后期試驗。

1.3.3 可溶性單寧含量測定 采用福林酚方法[12]進行可溶性單寧含量測定。沒食子酸用于標準曲線的制作，每次測量重復3次，每個點進行3次生物學重復。可溶性單寧的質量分數用果實質量的百分含量表示。

1.3.4 PPO基因的克隆與表達 進行PPO基因的克隆[11]，根據前期RNA-seq獲得PPO基因序列，利用Primer 3在線軟件（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）設計引物（表1）。按照試劑盒PCR擴增所得的目標片段連接，轉化到大腸桿菌DH5α（TaKaRa公司），挑選陽性克隆并進行測序驗證。

進行PPO基因表達試驗[12]，包括模板合成、引物特異性檢測、實時定量PCR（QPCR）分析。

2 結果與分析

2.1 95% CO2處理對柿果實可溶性單寧含量的影響

可溶性單寧是柿果實澀味的主要呈現者，可溶性單寧含量越高則澀味越嚴重。試驗測定了對照組及95% CO2處理2 d后的柿果實可溶性單寧含量。結果表明，經95% CO2處理后，可溶性單寧含量僅為0.19%，明顯低于對照組的1.40%（圖1），這與已有研究的結論[12]相一致。可見，95% CO2處理能明顯降低“恭城水柿”的可溶性單寧含量，實現柿果實的脫澀。

2.2 95% CO2處理對柿果實褐變的影響

將95% CO2處理后的柿果實切片為3.0 cm×3.0 cm×0.3 cm，于室溫放置12 h后觀察拍照（圖2）。結果表明，對照果實無明顯變化；經95% CO2處理后的果實切片褐變現象明顯，這與已有研究的結論[5]相一致。可見，95% CO2處理能使“恭城水柿”在貯藏后期發生褐變。

2.3 柿果實PPO基因的克隆與表達

根據前期RNA-seq結果設計PPO基因克隆引物、熒光定量PCR引物（表1），并克隆獲得PPO基因部分片段序列，命名為DkPPO。與馬鈴薯、蘋果、番茄的PPO基因進行聚類分析顯示，DkPPO與蘋果PPO基因同源關系較近（圖3）。進一步基因表達分析表明，該PPO基因在CO2處理后的鮮切柿片中的表達量比對照低（圖4），表明該PPO基因可能未參與柿果實脫澀處理后的褐變。

3 結論

本研究探討了CO2處理對“恭城水柿”褐變的影響。結果表明，柿果實經95% CO2處理后，其可溶性單寧含量明顯下降，柿果實完成脫澀。脫澀后的柿鮮切片于20 ℃下放置12 h后發生明顯褐變。克隆獲得PPO基因部分片段序列，基因表達結果顯示，DkPPO基因在CO2處理后的鮮切柿片中的表達量比對照低，表明該PPO基因可能未參與柿果實脫澀處理后的褐變。CO2處理導致“恭城水柿”褐變的原因有待進一步研究。

參考文獻：

[1]Wang R Z，Yang Y，Li G C. Chinese persimmon germplasm resources[J]. Acta Horticulturae，1997，436：43-50.

[2]Min T，Yin X R，Shi Y N，et al. Ethylene-responsive transcription factors interact with promoters of ADH and PDC involved in persimmon（Diospyros kaki）fruit de-astringency[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63（18）：6393-6405.

[3]Taira S，Ono M，Otsuki M. Effects of freezing rate on astringency reduction in persimmon during and after thawing[J]. Postharvest Biology and Technology，1998，14（3）：317-324.

[4]Akagi T，Ikegami A，Tsujimoto T，et al. DkMyb4 is a Myb transcription factor involved in proanthocyanidin biosynthesis in persimmon fruit[J]. Plant Physiology，2009，151（4）：2028-2045.

[5]Novillo P，Salvador A，Llorca E，et al. Effect of CO2 deastringency treatment on flesh disorders induced by mechanical damage in persimmon：Biochemical and microstructural studies[J]. Food Chemistry，2014，145：454-463.

[6]宋曉雪，胡文忠，畢 陽，等. 鮮切果蔬酶促褐變關鍵酶的研究進展[J]. 食品工業科技，2013，34（15）：390-393.

[7]Hunt M D，Eannetta N T，Yu H F，et al. cDNA cloning and expression of potato polyphenol oxidase[J]. Plant Molecular Biology，1993，21（1）：59-68.

[8]Nishimum M F C，Some Properties of Japanese pear（Pyrus pyrifolia） po1yphenol oxldase and changes in browning potential during fruit maturation[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2003，83：1156-1162.

[9]Liao Z，Chen R M. Molecular cloning and characterization polyphenol oxidase gene from sweet potato[J]. Molecular Biology，2006，40（6）：907-913.

[10]Li N Y，Wm C，Jin Q L，et al. Molecular cloning and expression of polyphenol oxidase gene from the mushroom，Agaricus bisporus[J]. Agricultural Science in China，2011，10（2）：185-194.

[11]張躍進，郝曉燕，梁宗鎖，等. 蓮藕多酚氧化酶基因（PPO）的克隆與表達分析[J]. 農業生物技術學報，2011，19（4）：634-641.

[12]Min T，Fang F，Ge H，et al. Two novel anoxia-induced ethylene response factors that interact with promoters of deastringency-related genes from persimmon[J]. PLoS One，2014（9）：e97043.