葛根素及黃豆苷元分離純化工藝研究

楊紫薇+王舒雅+高俊+馮遲+陳怡露+雍曉雨+周俊+劉曉寧+謝欣欣+鄭濤

摘要： 采用HPD800大孔吸附樹脂富集葛根中的葛根素及黃豆苷元，并通過溶劑萃取以及重結晶技術分離純化葛根素及黃豆苷元。試驗結果表明：經過大孔吸附樹脂富集后，葛根素的純度從8.62%增加到35.26%、黃豆苷元的純度從0.276%增加到10.17%；以水飽和的正丁醇作為葛根素萃取溶劑，萃取2次萃取率可達92.32%；選取乙酸乙酯作為黃豆苷元的萃取溶劑，萃取1次萃取率達到94.75%；選取90%乙酸作為葛根素結晶的溶劑，經過1次結晶，葛根素的純度可達91.32%，收率為12.5%，黃豆苷元的純度可達93.81%，收率為15.77%。

關鍵詞： 葛根素；黃豆苷元；大孔樹脂；富集；分離；純化

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0297-03

葛根是豆科植物葛的根，是一種在我國常見的中藥材，素有“亞洲人參”的美譽，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉的功效[1]。我國的葛根種類有10多種，較為常見的有粉葛和野葛2種，其中粉葛的淀粉含量較高，常用于淀粉食品的加工；野葛主要以野生為主，異黃酮含量較高，主要用于提取有效藥用成分[2-3]。葛根中的有效藥用成分是異黃酮類物質，主要包括葛根素和黃豆苷元[4]。葛根素具有降低血糖、改善心腦循環、抗氧化、延緩動脈硬化、延緩衰老、抗腫瘤等作用，國內臨床上主要用于治療心絞痛、高血壓等心腦血管疾病，有資料表明葛根素對于心腦血管疾病的治愈率可以達到 97.6%[5-7]。黃豆苷元則對于治療更年期婦女綜合征、乳腺癌、預防骨質疏松有顯著的療效[8-9]。近年來中國的老齡化趨勢明顯，患心腦血管的患者增多，對葛根異黃酮類藥物原料的需求越來越大。因此，設計高效分離純化葛根素和黃豆苷元的工藝方法成為當下研究熱點。

大孔樹脂是一類以吸附作用對有機物進行濃縮、分離作用的高分子聚合物[10-11]。近年來大量文獻報道采用大孔樹脂分離純化葛根素，但是葛根素的純度均不高。劉慧敏等用HPD-200A型大孔樹脂純化葛根素，得到的粗提取物的純度可以達到27.23%[12]。而且，近年來文獻中從葛根素異黃酮中分離純化葛根素的很多，忽略了黃豆苷元的價值。本試驗采用HPD800大孔樹脂富集葛根素和黃豆苷元，并采用溶劑萃取法，研究萃取次數對于萃取率的影響，再通過合適的溶劑結晶得到高純度葛根素和黃豆苷元。

1 材料與方法

1.1 材料

葛根[Pueraria lobata （Willd.） Ohwi]購自江蘇句容藥材市場，陰干，粉碎。對照品葛根素（純度≥99%）、黃豆苷元（純度≥98%），Sigma公司產品；測定含量用乙腈，J&K Chemical Ltd產品；乙酸，Sigma公司產品，色譜純；去離子水自制；大孔吸附樹脂HPD800，鄭州勤實科技有限公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗儀器

Agilent 1260LC高效液相色譜儀配G1311-B自動進樣器、G1311-B四元泵、G1316-A柱溫箱、G1314-F紫外檢測器，美國Agilent公司；Milli-Q純水儀，美國Millipore公司；ZWY-110X50恒溫水浴振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；玻璃層析柱（1.5 cm×30 cm），天津玻璃儀器廠；RE-52A 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 分析方法

采用高效液相色譜法檢測樣品液中葛根素及黃豆苷元含量[13]。采用以下色譜條件： Agilent ODS-C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：A相為含0.1%乙酸的乙腈溶液，B相為含0.1%乙酸的水溶液（流動相配比見表1）；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長250 nm；進樣量5 μL。

1.4 葛根素及黃豆苷元標準曲線的建立

精確稱取干燥至恒質量的葛根素標準品5.00 mg、黃豆苷元標準品3.00 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，作為標準品貯備液（葛根素：500 μg/mL，黃豆苷元：300 μg/mL）。用甲醇稀釋標準品儲備液配制成以下濃度：葛根素：250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL；黃豆苷元：150、75、37.5、18.75、9.375 μg/mL。分別用0.22 μm濾膜過濾后按“1.3”節中的色譜條件重復進樣3次進行檢測，得到液相結果后，以葛根素和黃豆苷元濃度為橫坐標，以峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，得葛根素和黃豆苷元回歸方程：y=23 932x-22.81（r2=0.999 6）和y=33 927x-50.60（r2=0.999 6）。葛根素和黃豆苷元的濃度分別在10～300 μg/mL和5～250 μg/mL范圍內時葛根素和黃豆苷元的濃度與峰面積線性關系良好。

1.5 葛根提取液的制備

準確稱取5 g葛根粉末（過60～80目篩），按照葛根粉末 ∶ 乙醇=1 g ∶ 8 mL加入體積分數為70%的乙醇浸泡2 h，再以90℃水浴回流提取2 h后趁熱濾去葛根渣，并收集濾液。利用旋轉蒸發儀將濾液蒸成浸膏，并將浸膏烘干得葛根黃酮粉末，用去離子水配置成葛根素和黃豆苷元的含量分別為1.527、0.140 mg/mL的溶液備用。

1.6 葛根素及黃豆苷元富集液的制備

1.6.1 葛根素和黃豆苷元的上樣吸附 選用大孔樹脂HPD800富集葛根提取液中的葛根素及黃豆苷元，具體操作如下：稱取10.0 g預處理好的樹脂，采用濕法裝柱，測得柱體積（1 BV）為14 mL；將提取液pH值調至6，在25℃條件下進行吸附，流速為1 BV/h。

1.6.2 葛根素及黃豆苷元富集液的制備 當樹脂吸附飽和后，用1 BV去離子水洗滌樹脂除去雜質，在25℃條件下用70%乙醇解吸，流速為1 BV/h，得葛根素和黃豆苷元富集液。按式（1）計算葛根素及黃豆苷元的純度：

P=CpVp Mp×100%。

（1）

式中：P為葛根素或黃豆苷元樣品純度，%；Cp為葛根素或黃豆苷元樣品濃度，mg/mL；Vp為樣品溶液的體積，mL；Mp為葛根黃酮粉末質量，mg。

1.7 葛根素及黃豆苷元的分離純化

1.7.1 葛根素和黃豆苷元的分離 將富集液減壓濃縮至無醇味，取10 mL分別加入10 mL乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷進行萃取[14-15]，HPLC檢測其有機溶劑中的葛根素和黃豆苷元的含量，選擇合適的萃取溶劑，按式（2）計算葛根素及黃豆苷元的萃取率：

G=CgVg Mg×100%。

（2）

式中：G為葛根素及黃豆苷元的萃取率，%；Cg為萃取劑中葛根素和黃豆苷元的濃度，mg/mL；Vg為萃取溶液的體積，mL；Mg為富集液中葛根素及黃豆苷元的質量，mg。

1.7.2 黃豆苷元結晶 選取合適的有機溶劑作為黃豆苷元的萃取溶劑，并考察萃取次數對于黃豆苷元萃取率的影響。然后將黃豆苷元萃取液減壓蒸干得黃豆苷元粗品，稱取黃豆苷元粗品1.0 g，加入40 mL 50%乙醇溶液進行結晶。

1.7.3 葛根素結晶 將“1.7.1”節中萃余相減壓濃縮，除去其中少量的有機溶劑，以水飽和的正丁醇為萃取溶劑萃取其中的葛根素，并考察萃取次數對于葛根素萃取率的影響。然后將葛根素萃取液減壓蒸干得葛根素粗品，稱取葛根素粗品1.0 g，加入40 mL 90%乙酸溶液進行結晶。

2 結果與分析

2.1 葛根素及黃豆苷元富集液的制備

2.1.1 提取液的上樣吸附 本試驗采用大孔樹脂HPD800對葛根素和黃豆苷元進行吸附，試驗結果如圖1所示：當上樣液中葛根素及黃豆苷元的含量分別為1.527 mg/mL和0.140 mg/mL，上樣流速為1 BV/h時，上樣液用量為840 mL（60 BV），此時樹脂對葛根素及黃豆苷元的吸附均已達飽和，其飽和吸附量分別為（71.78±0.75） mg/g和（21.77±0.01）mg/g。

2.1.2 葛根素及黃豆苷元富集液的制備 以70%的乙醇溶液為解析液對樹脂上吸附的葛根素及黃豆苷元進行解析。試驗結果如圖2所示：在解析流速為1 BV/h時，解析液用量為140 mL（10 BV），此時葛根素及黃豆苷元的吸附均可解析完全。經過大孔樹脂分離純化后，葛根素的純度從8.62%增加到35.26%、黃豆苷元的純度從0.276%增加到10.17%，且葛根素和黃豆苷元的回收率分別為81.71%和79.59%。

2.2 葛根素及黃豆苷元的分離純化

2.2.1 葛根素和黃豆苷元的分離 葛根素和黃豆苷元的極性相差較大，且在同種溶劑中的溶解度相差較大，因此本試驗擬通過溶劑萃取技術，達到富集液中葛根素和黃豆苷元分離的效果。本試驗考察了不同有機溶劑對葛根素和黃豆苷元萃取率的影響，結果見表2。可以看出，用乙酸乙酯可以對葛根素和黃豆苷元達到很好的分離效果，對黃豆苷元的萃取率高達（96.75±1.33）%。且乙酸乙酯較三氯甲烷和乙醚安全性更高，故而選擇乙酸乙酯作為葛根素和黃豆苷元的分離溶劑。

2.2.2 萃取次數對葛根素和黃豆苷元萃取率的影響 選擇乙酸乙酯作為黃豆苷元的萃取溶劑，并考察了萃取次數對黃豆苷元萃取率的影響，結果（表3）表明，等體積乙酸乙酯萃取1次就能將溶液中大部分的黃豆苷元萃取出來， 因此選擇黃豆苷元的萃取次數為1次。選擇水飽和的正丁醇作為葛根素的萃取溶劑，并考察了萃取次數對葛根素萃取率的影響，結果（表3）表明，等體積水飽和的正丁醇萃取2次能將溶液中大部分黃豆苷元萃取出來，因此選擇葛根素萃取次數為2次。

2.2.3 葛根素結晶 將葛根素及黃豆苷元粗品分別用10%乙酸和50%乙醇結晶1次，得到葛根素和黃豆苷元產品，其純度分別為91.32%和93.81%，回收率分別為12.5%和15.77%。圖3給出了葛根素（A）及黃豆苷元（B）結晶后的HPLC色譜圖，可以看出，經過不同的溶劑結晶后，葛根素及黃豆苷元樣品中的雜質含量顯著減少。

3 結論

經過HPD800型大孔吸附樹脂富集后，葛根素的純度從8.62%增加到35.26%、黃豆苷元的純度從0.276%增加到10.17%，用乙酸乙酯可以對葛根素和黃豆苷元達到很好的分離效果并且同時萃取黃豆苷元，萃取的次數對于萃取率來說也有很大的影響。以水飽和的正丁醇作為葛根素萃取溶劑，萃取2次萃取率可達92.32%。黃豆苷元用乙酸乙酯萃取1次的萃取率就可以達到94.75%。

選取90%乙酸作為葛根素重結晶的溶劑，經過1次重結晶，葛根素的純度可達91.32%，收率為12.5%，黃豆苷元的純度可達93.81%，收率為15.77%。

本研究所提出的方法可以快速有效地分離、純化葛根素和黃豆苷元，適合用于葛根素和黃豆苷元的工業化生產。

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