大孔樹脂分離純化苦蕎麥中總黃酮的工藝

黃莎+陳慶富+黃小燕

摘要： 以總黃酮為指標，經過動態吸附，探討提取物溶液濃度、pH值、流速、樹脂類型等因素對總黃酮吸附性能及不同洗脫劑（乙醇）濃度、用量對總黃酮洗脫效果的影響，確定分離純化苦蕎麥中總黃酮工藝的最佳參數。結果表明，大孔樹脂D-101的最佳吸附條件為蕎麥提取液濃度為0.30 g/mL、pH值為5、吸附流速為4 BV/h；最佳純化條件為水洗用量80 mL，洗脫劑濃度為50%、用量為90 mL。最佳吸附條件下，蕎麥提取液中總黃酮純度最高為25.69%。

關鍵詞： 苦蕎麥；分離純化；總黃酮；大孔樹脂；工藝；參數

中圖分類號： S517.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0303-03

苦蕎麥屬蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬苦蕎種（Fagopyrum tataricum Gartn.），別稱苦蕎，性喜冷涼氣候，適應能力強，宜在高海拔地區生長，生長周期相對較短，約70 d，主要分布于我國四川涼山、云、貴、晉、冀等處[1-4]。我國西南地區是世界苦蕎的主產區，具有豐富的栽培品種和野生資源，是遺傳育種及開展其他科研工作所需材料的重要原產地[5-6]。

苦蕎麥是一種重要的糧、飼、藥兼用的植物資源，營養豐富，對預防心血管疾病、降血糖、增強免疫力、抗癌、抗氧化、護肝、抗炎、抗過敏等具有很好的效果[7-16]。因此，苦蕎麥的消費市場在近幾年逐年擴大，其有效成分蕓香苷、槲皮素、山奈酚和桑色素等在食品、化妝、醫藥等行業的需求也越來越大。另外，由于苦蕎麥中含有豐富的類黃酮化合物，苦蕎米茶、苦蕎面食、苦蕎醋、苦蕎啤酒等苦蕎麥加工品也越來越受到人們喜愛。但是，由于苦蕎麥類黃酮化合物未能實現高效分離純化，苦蕎麥類黃酮的提取至今未形成大規模的工業化生產。大孔吸附樹脂分離純化總黃酮的工藝已取得顯著成效[17]，本試驗在采用大孔吸附樹脂分離純化苦蕎麥中總黃酮的基礎上，研究苦蕎麥總黃酮的分離純化工藝，以期為苦蕎麥總黃酮的工業化提取提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

四倍體苦蕎1307-1178的種子，由貴州師范大學蕎麥研究所提供，并經陳慶富教授鑒定；樹脂分別為非極性D-101、極性DA-201、中等極性DM-301大孔樹脂，由天津市光復精細化工研究所提供；標準曲線對照品為蕓香苷（類黃酮類物質），由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取液的制備 參考盛華剛等的方法[18]制備提取液：稱取苦蕎麥300 g，粉碎成粗粉；用3 000 mL 70%乙醇提取3 h；用1 500 mL 70%乙醇提取1.5 h，重復2次；合并3次提取液，回收乙醇，濃縮；定容到濃度為0.6 g/mL，搖勻，作為上柱溶液。

1.2.2 大孔樹脂的處理 用95%乙醇浸泡大孔樹脂24 h，裝柱；用95%乙醇洗滌，至流出液與水的混合液不出現渾濁為止；用蒸餾水反復洗滌至無醇味[19]。

1.2.3 蕓香苷標準曲線的繪制 用70%乙醇配制 0.123 mg/mL 蕓香苷作為對照品；精確吸取對照品0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL分別置于10 mL試管中，分別加入2 mL 0.1 mol/L 三氯化鋁溶液、3 mL 1 mol/L乙酸鉀溶液，加70%乙醇至10 mL，搖勻，放置30 min；以試劑作為空白，用分光光度計測定波長為420 nm處吸光度[20]。重復3次，3次測定數據相差均在0.005以內。以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，得回歸方程：Y=29.379X-0.010 5，相關系數r=0.999 3，線性范圍為0.005～0.030 mg/mL。

1.2.4 吸附試驗

1.2.4.1 大孔樹脂型號的選擇 分別量取D-101、DM-301、DA-201、混合型（D-101、DM-301、DA-201，等比例混合）4種型號的樹脂各18 mL，裝柱；加入苦蕎麥提取液 40 mL，流速為0.5 mL/min，過柱；100 mL水洗，流速為 0.5 mL/min；100 mL 70%乙醇洗脫，流速為0.5 mL/min；測定流出液、水洗脫液和乙醇洗脫液黃酮的含量，以黃酮的比吸附量和比洗脫率為指標，選擇吸附效果較好的大孔樹脂。

1.2.4.2 吸附條件的優化 提取液濃度、流速、pH值等因素對樹脂吸附黃酮的影響較大[21] 。試驗采用L9（34）正交試驗設計，以考察不同提取液濃度、流速、pH值（表1）對總黃酮比吸附量的影響，選出最佳吸附條件。最后均以流速為 2 BV/mL 的100 mL水洗，測定流出液、水洗脫液中黃酮的含量，計算比吸附量。

1.2.5 純化條件的選擇

1.2.5.1 水洗量的選擇 按最優條件吸附。以10 mL遞增進行水洗，接取水洗脫液；分別取2 mL洗脫液檢測糖含量，取8 mL蒸干，測定干膏質量；以干膏質量、Molish識別反應判定水洗量。

1.2.5.2 洗脫劑濃度的選擇[22] 按最優條件進行吸附和水洗。分別用20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的150 mL乙醇進行洗脫，流速為2 BV/h；測定乙醇洗脫液中黃酮含量，計算比洗脫量；確定洗脫劑乙醇的使用濃度。

1.2.5.3 洗脫劑乙醇的用量 按最佳條件進行吸附、水洗。50%乙醇以10 mL遞增進行洗脫，收集流出液，測定其總黃酮量。

1.2.6 黃酮純度測定 參照賈韶千等方法[23]進行：將純化前后的黃酮溶液分別減壓濃縮、干燥，得到總黃酮粉末；精確稱取純化前后黃酮粉末各50 mg，分別溶于80%乙醇，定容至50 mL；測定黃酮含量，計算黃酮純度；重復3次。干膏收率和黃酮回收率計算公式分別為：

干膏收率=干膏質量/凈藥材投入量×100%；

黃酮回收率=50%乙醇洗脫液中黃酮含量/總黃酮上樣量×100%。

2 結果與分析

2.1 苦蕎麥中總黃酮的吸附

由表2可見，D-101大孔樹脂的比吸附量和比洗脫量均為最大，可見D-101大孔樹脂對黃酮有較好的吸附和洗脫效果。因此，采用D-101大孔樹脂作為吸附樹脂。

2.2 D-101大孔樹脂吸附條件的優化

由表3、表4可見，極差（R值）大小為D>A>B，因素A和D的離差平方和（SS）值較大，這表明 pH值對黃酮吸附量的影響相對最大，濃度次之，流速最小。由于流速的影響較小，考慮時間問題，因此最佳吸附工藝條件為A2 B2 D1，即提取液濃度0.30 g/mL、流速4 BV/h、pH值為5。

2.3 純化條件的選擇

2.3.1 水洗量的選擇 由表5可見，水洗量為40 mL時，水洗脫液的Molish反應為陰性（-）；當用水量為80 mL時，干膏質量為0 mg。因此，水洗量以80 mL為最佳。

2.3.2 洗脫劑濃度的選擇 由圖1可知，乙醇濃度為20%～50%時，比洗脫量呈上升趨勢；乙醇濃度為50%～60%時，比洗脫量達到最高值；60%之后略有下降。對50%、60%乙醇洗脫液的比洗脫量和干膏質量進行比較，由表6可見，50%、60%乙醇洗脫液的干膏質量均為37 mg，而50%乙醇洗脫液的比洗脫量高于60%乙醇。因此，選定洗脫劑濃度為50%。

2.3.3 洗脫劑用量的選擇 由圖2可見，乙醇量達90 mL時，總黃酮基本洗脫完全。因此，確定洗脫劑乙醇的用量以90 mL為最佳。

2.4 黃酮純度測定

由表7可見，在優化條件下，黃酮純度最高可達 25.69%；黃酮洗脫量、干膏收率與其他2組相差較小，黃酮回收率較高，優選的純化工藝穩定可行。

3 結論

試驗采用D-101、DA-201、DM-301、混合型4種型號的大孔樹脂作為吸附材料，結果表明，混合型吸附效果不如 D-101理想，D101大孔樹脂是一種非極性吸附劑，苦蕎麥中黃酮主要被D-101吸附。大孔樹脂對苦蕎麥中黃酮的最佳分離純化工藝為：蕎麥提取液濃度為0.3 g/mL、pH值為5、吸附流速為4 BV/h；純化條件為水洗用量80 mL，洗脫劑（乙醇）濃度為50%、用量為90 mL。經過該工藝條件分離純化苦蕎麥中黃酮的純度是純化前的2.7倍，工藝條件溫和，分離效果較好，能提高有效成分的相對含量、產品不易吸潮、生產周期較短、樹脂可再生、能重復使用。

需要說明的是，苦蕎麥乙醇提取液在回收乙醇并用水定容后，有不溶物質的存在，如果直接上柱分離會堵塞樹脂，樹脂的吸附能力會受到影響。因此，需要對提取液進行處理，將回收乙醇后的提取液進行過濾，將不溶物用熱水溶解并繼續過濾，直至到定容點。

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