舟形藻生長運動過程對重金屬Cu2+急性毒性脅迫響應研究

劉超+支崇遠+李培林+易婷婷+張立微

摘要： 以浮游硅藻舟形藻（Planktonic diatoms Navicula）為受試藻，研究其在不同濃度Cu2+ 脅迫下生長和運動變化特征。試驗以96 h半致死濃度（EC50）、葉綠素a 含量及綜合運動等指標研究Cu2+ 對舟形藻的毒性響應。Cu2+ 對舟形藻 96 h EC50 值為 4.510 mg/L；Cu2+ 對舟形藻葉綠素a 累積最大抑制率為50%；運動速率在1.127 5 mg/L附近達到最高，表現出“中毒興奮”，隨后速率線性下降。舟形藻葉綠素a 含量對Cu2+ 反應不敏感，其運動狀態可綜合指示Cu2+ 含量。利用舟形藻作為指示種來反映水體受Cu2+污染程度具有一定的可行性，同時可為農業、工業及生活污水中的Cu2+監測及評價提供依據。

關鍵詞： 舟形藻；Cu2+ 脅迫；急性毒性；生長；運動

中圖分類號： X52 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0373-03

Cu2+ 是舟形藻生長必需的微量營養元素之一，但當其超過正常需求量時，Cu2+會對硅藻產生毒性作用[1-2]。隨著人類對環境的各類干預，環境中Cu2+ 濃度大大提高[3]。由于重金屬有著毒性大、不易被代謝及易被生物富集等特點，嚴重威脅著水生生物和人類的生存[4]。硅藻為水生生態系統的初級生產者，在整個生態系統的物質循環與能量流動中有著重要的作用[5]。進入硅藻中的 Cu2+ 可通過水生食物鏈食物網富集到高等動物體內，最終進入人體危害人類健康，同時 Cu2+ 將影響硅藻細胞的種群增長，導致水生生態系統中初級生產力下降，進而破壞整個生態系統的平衡[6-7]。

貴州省貴陽市的小車河濕地作為居民飲用水源地之一，水質長期以來受到Cu2+ 等重金屬的影響，其治理與監測備受關注。本研究通過 Cu2+ 的急性毒性脅迫對舟形藻的生長和運動過程的觀察[8]，對舟形藻在相同脅迫條件下表現出不同的生長及運動特點進行了線性相關分析，為探索舟形藻對Cu2+ 毒性脅迫的響應、舟形藻生長和運動速率與Cu2+濃度間的變化關系奠定研究基礎[9]，同時為舟形藻作為指示種，監測水環境重金屬污染提供新角度[10]。

1 材料與方法

1.1 試驗藻種及培育方法

舟形藻采自貴州省貴陽市小車河濕地，應用微藻微吸管分離方法分離。原液經沉淀、過濾（0.45 μm 微孔濾膜），121.3 ℃滅菌 30 min。采用自制培養液加富的滅菌原液中培養。置于無菌培養室中培養，溫度（20±1） ℃，光照度 66 μmol/（m2·s），光-暗周期12 h-12 h，pH 值7.5 左右。經預培養和擴大培養得到舟形藻純種，在獲得足夠藻液后進行試驗。微藻培養瓶定時搖動3次/d，預防附壁生長。

1.2 試驗儀器及設備

光學顯微鏡（深圳市新明光學儀器有限公司，XSP-2CA生物顯微鏡）、光學顯微鏡物鏡測微尺（深圳市新明光學儀器有限公司，C6 物鏡測微尺）、電子秒表（PC2810）、照相機（Nikon-COOLPIX5400）、載物片、血球計數板。

1.3 試驗方法

1.3.1 藻種擴大培養 試驗藻種在自制培養液加富的滅菌原液中進行擴大培養，自制培養基各成分質量濃度為：NH4Cl 15 mg/L，MgCl2·6H2O 12 mg/L，MgSO4·7H2O 15 mg/L，KH2PO4 2.3 mg/L，NaHPO4 50 mg/L，FeC6H5O7·5H2O 50 mg/L，Na2EDTA·2H2O 45 mg/L，MnCl2·4H2O 160 mg/L，ZnSO4 25 mg/L，CoCl2·6H2O 10 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.007 mg/L，維生素B12 0.5 mg/L，維生素B1 50 mg/L，維生素H 0.5 mg/L。

1.3.2 急性毒性試驗 試驗設置 1個空白組和 4個試驗組，根據預試驗結果各組中Cu2+的質量濃度分別為0、1.5、2.5、3.5、4.5 mg/L。硅藻初始含量為70 000 cells/mL。每個質量濃度設置3個平行組，試驗所有容器和培養基均經過121 ℃、20 min高壓蒸氣滅菌。試驗共進行96 h，0、24、48、72、96 h取樣后，使用血球計數板觀察及統計運動數據。觀察時，搖勻培養瓶至藻液顏色統一，每日定時取樣，取1 mL充分混勻的藻液，加適量魯格氏固定液（Lugol），混勻后取 200 μL 藻液用血球計數板計數，每個樣品計數3次，取平均值。之后按照下式計算出抑制率X=（I0-I）/I0×100%，以抑制率作圖，利用加權直線回歸法建立線性回歸方程，并計算各時間段的半致死濃度（EC50）值。

1.3.3 亞急性毒性試驗 設置1個對照組和4個試驗組，根據急性毒性試驗結果，設置質量濃度分別為96 h EC50，96 h EC50/2，96 h EC50/4，96 h EC50/8。硅藻初始含量為7 000 cells/mL。容器為500 mL三角培養瓶，培養體積為200 mL。共進行15 d，其他條件與“1.1”節相同。在試驗的前5 d每天對各組進行取樣，之后每2 d取樣1次，共取樣9次，每次取樣10 mL，其中5 mL 進行葉綠素a 含量測定并對硅藻細胞的運動狀態進行觀察。

1.3.3.1 葉綠素a含量測定 取5 mL藻液，應用文獻[11]中葉綠素a含量的測定方法，對硅藻葉綠素a含量進行測定。

1.3.3.2 舟形藻運動狀態觀察與分析 對舟形藻的運動過程錄像，利用血球計數板上線的交點記錄硅藻的行動距離，并用秒表計時，對計數框內硅藻的最大運動速率和平均運動速率進行計算。舟形藻運動狀態參數包括平均運動速率、最大運動速率和運動硅藻占總數的比率。通過錄像觀察，對計數框內硅藻進行計數，得出硅藻總數和30 s內所有運動硅藻數量，并記舟形藻運動2 μm所耗時間。以上過程按照計數框內硅藻的數量重復3～5次，其中，最大運動速率取最大值，平均運動速率取平均值，運動硅藻占總數的比率取各計數框中運動硅藻總數占所有計數框中硅藻總數的比率。

2 結果與討論

2.1 Cu2+急性暴露對舟形藻的影響

在不同質量濃度Cu2+脅迫下，舟形藻的生長曲線見圖1。與空白組相比，添加1.5、2.5 mg/L Cu2+的試驗組舟形藻的生長受到一定的促進，且促進程度與Cu2+ 質量濃度呈正相關，表現出明顯的毒性興奮效應。在 2.5 mg/L試驗組中，在24 h時抑制率為 -2.44%，之后呈線性增加；而在3.5 mg/L、4.5 mg/L 試驗組中，在96 h時抑制率為0.23%、0.56%，表明其生長明顯受到抑制。

使用加權直線回歸法分析計算，Cu2+對舟形藻各時間的EC50和95% 置信區間見表1。各時間段EC50 值較為穩定，都在4.510 mg/L左右，說明隨時間的延長Cu2+ 對舟形藻的毒性無降低，未產生長期毒性，不會對舟形藻產生持續性影響。

2.2.1 Cu2+對舟形藻葉綠素a含量的影響 在不同質量濃度Cu2+ 脅迫下的藻液，經過 15 d 培養，以葉綠素a 的質量濃度為指標的曲線見圖2。在開始脅迫的前3 d葉綠素質量濃度有明顯的增加趨勢，與對照組差距很小，但隨時間的推移Cu2+ 對舟形藻葉綠素a含量的抑制作用漸漸增大，5 d時 4.510 mg/L 的質量濃度下對葉綠素的抑制率達到50%，最終抑制率持續下降穩定在30%左右。表現出一定的質量濃度計量效應。7～13 d葉綠素a含量保持穩定，而在15 d時，各組葉綠素a含量均略有增加，這可能與Cu2+ 被從離子態代謝固化為相對穩定的化合物有關。

2.2.2 Cu2+ 對舟形藻運動狀態的影響

2.2.2.1 Cu2+ 對運動硅藻數量占總硅藻數量比率的影響 添加不同質量濃度Cu2+ 脅迫下的舟形藻，各組中運動硅藻數量占總硅藻數量比率見圖3。由圖3可知：在同等條件下隨時間增長運動硅藻數量占總硅藻數量的比率減小，暴露1 d后運動硅藻數量占總硅藻數量的比率未出現明顯變化。在 2～5 d期間，隨Cu2+質量濃度增高硅藻占總硅藻的比率出現顯著下降。隨后，雖有一定降低趨勢，但是變化相對較小。由此可見Cu2+對運動硅藻的數量有一定影響。

2.2.2.2 Cu2+ 對硅藻平均運動速率的影響 經過15 d的培養，以最快運動速率為指標的曲線見圖4。前1～3 d 速率變化較穩定，兩端相近，中間波動較大；之外其他的總體運動速率都隨質量濃度的增高而降低，但是在4 d、2.255 mg/L 以及 7 d、1.127 5 mg/L 時出現 2 個異常值，平均運動速率分別達到1.0、1.3 μm/s，明顯偏高。但是與該組其他慢速運動硅藻相比，運動距離和時間均較短，快速運動2～5 s后就停止運動或轉為慢速運動。

2.2.2.3 Cu2+ 對硅藻最快運動速率的影響 經過15 d的培養，以最快運動速率為指標的曲線見圖5。除1 d和15 d速

率變化明顯之外其他的總體運動速率都隨質量濃度在0.563 75 mg/L 和1.127 5 mg/L附近增高而增高，在2.255 mg/L 附近轉而降低。但是在4 d、1.127 5 mg/L 以及11 d、0.563 75 mg/L 時出現2 個異常值運動速率分別達到 0.8、1.03 μm/s，速度明顯降低。但是與該組與其他慢速運動硅藻相比，運動距離和時間均較短，快速運動5～7 s后就停止運動或轉為慢速運動。

3 結論

硅藻作為自然界中重要的初級生產者，對生態系統的穩定起著重要作用。通過其在Cu2+脅迫下運動變化的研究，能為在水環境評價監測、水污染治理等方面提供一定的理論依據。利用硅藻種類、數量及變化作為評價水生態環境質量指示物種的做法由來已久，而利用硅藻運動速率變化對水質中不同污染離子濃度測定的研究相對很少。相關研究表明，在眾多除藻劑中銅的殺藻作用有效、穩定、價格低廉、且對人體健康的毒性作用低，目前在國外已有大量使用[12-14]。

本試驗就96 h EC50值（4.51 mg/L）來看，參照《水和廢水監測分析方法》的規定[11]為中毒，與小球藻（55.62 mg/L）[15]低毒差距較大。原因是不同的藻類由于生存方式、運動類型及生存環境不同。另外部分Cu2+可能會被舟形藻富集代謝為相對離子態更為穩定的化合物，對水生生物進而對水生生態系統產生直接或間接的影響。

葉綠素a含量對Cu2+的反應呈現一定的梯度變化，1～5 d 和對照組相比，葉綠素a的累積較快，表現出“促進”作用；6～11 d后含Cu2+各組與對照組出現一定差異（P<0.05），而在同一天含Cu2+各組差異較小（P>0.05）。可見藻細胞中葉綠素a含量對Cu2+反應敏感，少量Cu2+對葉綠素a 含量的累積有明顯促進作用，但是之后隨質量濃度增大葉綠素a含量變化則逐漸降低，表現出一定的抑制作用；11～15 d，葉綠素a含量的累積出現一定的提高，可能與Cu2+被富集代謝而濃度降低有關[16]。

Cu2+急性毒性脅迫能顯著影響舟形藻的運動速率。低濃度0.563 75～1.127 5 mg/L 區間內 Cu2+脅迫能刺激舟形藻運動，使其表現出毒物的“興奮效應”，隨著脅迫濃度的增大和脅迫時間的延長，Cu2+對舟形藻的運動表現出明顯的抑制效應，在1.127 5 mg/L附近達到最高之后，速率線性下降，在2.255 mg/L趨近無脅迫速率。表明隨著脅迫濃度的提高，舟形藻細胞提高了對脅迫的適應能力，抗性得到一定的增強。

硅藻在受Cu2+污染水質處理的治理運用方面有一定的可行性，同時對農業、工業及生活污水中的Cu2+監測方面有廣闊的應用前景[1，17]。本研究發現運動硅藻數量占總硅藻數量的比率和平均運動速率在2～3 d時變化較大，所以可以應用這2個指標在2～3 d時的值來對Cu2+的毒性進行綜合指示。

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