荔枝果皮LcMn—SOD、LcCu/Zn—SOD—1、LcCu/Zn—SOD—2、LcPRDX5的表達特性分析

嚴伶俐 甘小迎 韓冬梅 吳振先

摘 要：為探討LcMn-SOD（荔枝Mn-SOD）、LcCu/Zn-SOD-1（荔枝Cu/Zn-SOD-1）、LcCu/Zn-SOD-2（荔枝Cu/Zn-SOD-2）、LcPRDX5（荔枝過氧化物還原酶5）與荔枝低溫貯藏過程中果皮褐變的關系，該文以‘井岡紅糯和‘懷枝為試驗材料，采用實時熒光定量PCR對4個基因的表達特性進行分析。結果表明，在‘井岡紅糯和‘懷枝低溫貯藏前期，二者的褐變指數上升較緩慢，同時LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的表達量下降；貯藏21d后，4個基因的表達量升高，褐變指數迅速上升，貯藏后期嚴重褐變果皮中LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5表達量比貯藏前期高。低溫貯藏過程中，‘井岡紅糯的耐貯性高于‘懷枝，與之對應的 LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的表達也高于‘懷枝，但2個品種種4個基因表達的變化趨勢大致相同，LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5與荔枝果皮褐變密切相關。

關鍵詞：荔枝；果皮褐變；基因；表達

中圖分類號 S66 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）07-114-05

Abstract：In order to clarify the relationship between LcMn-SOD，LcCu/Zn-SOD-1，LcCu/Zn-SOD-2，LcPRDX5 genes and the pericarp browning of Litchi during the low temperatures torage，the method of qRT-PCR was used for the four genes expression in‘Jingganghongnuoand‘Huaizhi litchi. In this study，the pericarp gradually getting brown in the early stage of low temperature storage of the two cultivars，and at the same time ，the expression of LcMn-SOD，LcCu/Zn-SOD-1，LcCu/Zn-SOD-2，LcPRDX5 genes were decreased，but those genes mRNA accumulation increased with the browning index rose rapidly on 21th day at low temperature storage. The expression of LcMn-SOD，LcCu/Zn-SOD-1，LcCu/Zn-SOD-2，LcPRDX5 genes of the seriously browning fruit in the late stage of the storage were higher than the early stage of the storage. Compared with ‘Huaizhi，the storability of ‘Jingganghongnuo was better during the cold storage，and expression of the four genes were also higher，but they have asimilar expression pattern. As a result，LcMn-SOD，LcCu/Zn-SOD-1，LcCu/Zn-SOD-2，LcPRDX5 genes was closely related to the pericarp browning of Litchi.

Key words：Litchi；Pericarp browning；Gene；Expression

荔枝是我國南方重要的熱帶亞熱帶木本果樹[1]，采后果實極易衰老，果皮褐變[2]，很大程度上降低了其商品價值[3]。衰老的自由基理論認為，衰老的主要原因是細胞代謝過程中不斷產生自由基，保持體內自由基和抗氧化劑的平衡可以延緩衰老[4]。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物還原酶5（PRDX5）在清除植物體內的活性氧自由基的過程中發揮了重要作用，對于延緩荔枝果實衰老褐變具有重要意義。有研究表明，SOD是植物體內清除活性氧的第一道防線[5]，人們對其進行了廣泛的研究。SOD在植物界普遍存在，根據其金屬輔離子的不同，可分為 Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD[6]，Cu/Zn-SOD主要存在于細胞質中，Mn-SOD主要存在于線粒體中[7]，與植物的抗衰老等密切相關[8-9]。PRDX5也是清除活性氧的重要酶之一，在過氧化物酶體中普遍存在，催化過氧化氫和羥自由基轉化成對生物體無害的水和氧氣。過氧化物還原酶（PRDX）是一類不含輔基的巰基依賴性抗氧化蛋白酶，也是一類不含硒的過氧化物酶超家族，催化活性主要依賴于硫氧還蛋白的半胱氨酸，因此又稱之為硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）[10]。目前，對于SOD的研究主要集中在總的SOD上，對于荔枝果皮中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD的研究報道較少，而荔枝果皮中的PRDX5尚未見報道。為此，本研究以荔枝果皮為材料，采用實時熒光定量PCR技術對不同品種的荔枝低溫貯藏過程中LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的特異性表達進行分析，為今后深入研究LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5在荔枝果皮褐變中的作用機理與酶促調控研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料 試驗用井岡紅糯荔枝采自廣東省陽西縣華翔果場，懷枝采自廣東省從化市，采收成熟度為80%。挑選成熟度一致、無病蟲害、無機械損傷、大小一致的果實，不進行任何處理，直接使用0.02mm厚的聚乙烯袋包裝，每袋30個果，（4±1）℃下貯藏35d，每7d取一次樣，每次取3袋荔枝，剝下荔枝果皮，迅速用液氮固定，-80℃冰箱中保存備用。

1.2 褐變指數的評定 按照荔枝果皮外表面褐變面積的大小進行分級：0級：果實全紅，無褐斑，1級：龜裂片尖端有零星褐點，褐變面積小于1/4，2級：褐變面積占果實面積1/4～1/3，3級：褐變面積占果實面積1/3～1/2，4級：褐變面積占果實面積大于1/2～3/4，5級：全部褐變，褐變指數=∑（級數×各級果數）/總果數[1]。隨機取3袋龍眼果實，測定其內果皮褐變指數。

1.3 RNA提取檢測和cDNA的準備 以井岡紅糯和懷枝荔枝果皮為材料，總RNA的提取和純化過程依照北京華越洋生物科技有限公司植物RNA操作說明書進行。用生物分光光度計和1.2%的瓊脂糖變性膠電泳對RNA完整性做出評價。以mRNA為模板，使用TOYOBO的ReverTra Ace qPCR RT Kit 試劑盒進行反轉錄。用生物分光光度計測定其濃度，并分別稀釋到80ng/μL，-70℃備用。

1.4 熒光定量的引物設計和合成 根據LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的ID在荔枝全基因組中查找并獲得基因序列。根據熒光定量引物設計的規則，為保證擴增片段的特異性，引物設計的區域定于3′末端非翻譯區和翻譯區之間。引物擴增的長度在100～250bp，以保證較高的擴增效率。引物的長度在22bp左右，退火溫度在60℃附近或者更高。利用引物設計軟件Primer 5.0進行熒光引物設計，設計好的引物通過Oligo 6.0進行評價。當引物符合上述條件后，送上海生工生物有限公司合成。

1.5 引物的驗證和優化

1.5.1 普通PCR擴增驗證 引物合成后，以1.4中所制備的cDNA混合液作為模板，采用TaKaRa LA Taq酶進行PCR擴增反應。引物上下游在體系中的中濃度為250 nM。擴增反應體系（20μL）如下：2μL 10×rTaq Buffer（Mg2+Plus），2μL dNTP Mixture（2.5mM），2μL Forward primer （2.5μM），2μL Reverse primer（2.5μM），0.2μL r Taq 酶，2μL cDNA，用ddH2O定容到20μL?；靹蚝螅庞赑CR儀中反應程序如下：95℃、10min，95℃、30s，TM-5℃、30s，72℃、1min，30個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR反應結束后進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的特異性及其片段長度與引物設計的產物長度是否一致，以確定所擴增的片段為自己所克隆基因。

1.5.2 溶解曲線分析 在普通PCR對引物驗證的基礎上，進一步使用熒光定量PCR擴增，同時做無模板對照（No Template Control，NTC），通過溶解曲線分析，從更高的靈敏度檢驗引物對的純度和擴增的特異性，以及有無引物二聚體的形成。

1.6 標準曲線的制作 對驗證后的引物對進行標準曲線的制定。共設置7個濃度梯度，采用混合模板，進行梯度稀釋，10倍稀釋后，進行定量PCR擴增后計算基因的擴增效率。PCR反應體系：SYBER 10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SDW 7μL，cDNA 2μL，PCR儀中反應程序如下：95℃、10min，95℃、30s，TM-5℃、30s，72℃、1min，30個循環，最后72℃延伸10min。

1.7 不同品種荔枝果皮 LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5在低溫貯藏過程中的表達分析分別使用‘井岡紅糯和‘懷枝果皮不同貯藏時間的cDNA為模板，統一稀釋到80ng/μL，使用模板量為160ng。PCR反應體系：SYBER 10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SDW 7μL，cDNA2μL，PCR儀中反應程序如下：95℃、10min，95℃、30s，TM-5℃、30s，72℃、1min，30個循環，最后72℃延伸10min，并對擴增產物進行溶解曲線分析。熒光表達量計算采用2-△△CT法，10min，并對擴增產物進行溶解曲線分析。熒光表達量計算采用2-△△CT法，由熒光定量PCR儀軟件系統自動分析得出結果。

2 結果與分析

2.1 荔枝果皮褐變指數的變化 由圖1可知，井岡紅糯和懷枝果實低溫貯藏過程中，褐變指數隨著貯藏時間的增加呈現上升趨勢，貯藏7～21d果皮的褐變指數上升較慢，而后迅速褐變，并且在相同貯藏時間內‘懷枝褐變指數一直高于‘井岡紅糯，二者果實在采后35d完全褐變。

2.2 熒光定量引物驗證 如圖2所示，用于熒光定量的所有引物對的溶解曲線都只有一個單一的銳鋒，且NTC沒有引物二聚體產生，綜合引物對的普通PCR結果來看，所設計的引物符合熒光定量的引物要求。

2.3 標準曲線的制作 采用混合模板作為標準曲線的制作模板，共設置5個濃度梯度，進行10倍稀釋。從表1可見，目的基因的回歸系數R2均高于0.95，最高的為LcCu/Zn-SOD-1的0.997，最低的為LcPRDX5的0.960，表明標準曲線的線性關系很好。擴增效率均高于98%，最低為LcCu/Zn-SOD-1的98.2%，最高為LcPRDX5的117.1%，均在85%～120%，表明擴增效率較好。滿足后續試驗的參數標準，用2-△△CT法進行基因定量表達結果的數據分析。

2.4 LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5基因在2個品種荔枝低溫貯藏過程中的表達特性分析 LcMn-SOD在井岡紅糯荔枝和懷枝荔枝低溫貯藏過程中的各個時期都有表達，且果皮的相對表達量整體上都呈現下降的趨勢。懷枝荔枝果皮的LcMn-SOD的相對表達量在貯藏前期持續下降，28d達到一個峰值后急劇下降；井岡紅糯荔枝果皮的LcMn-SOD的相對表達量在14d出現峰值后迅速下降，貯藏的第21天和第28天的相對表達量基本沒有變化，而后先上升再下降；2個荔枝果皮的LcMn-SOD的表達量在低溫貯藏的后14d的趨勢完全相同（圖3A）。

LcCu/Zn-SOD-1和LcCu/Zn-SOD-2在‘井岡紅糯、‘懷枝低溫貯藏的各個時期都有表達，且2個基因整體的相對表達都呈現下降趨勢。LcCu/Zn-SOD-1在‘懷枝低溫貯藏過程中先持續下降，在28d達到峰值后迅速下降；而在‘井岡紅糯果皮中則是在14d達到峰值后起伏式下降，LcCu/Zn-SOD-1與LcMn-SOD在2個品種中對應的變化趨勢完全相同（圖3AB）。LcCu/Zn-SOD-2‘懷枝果皮先下降后略有上升再急劇下降，整體表達量下降；而在‘井岡紅糯果皮中則是起伏式下降后緩慢上升，整體表達量下降（圖3C）。由此可知LcCu/Zn-SOD在2個荔枝品種低溫貯藏過程中表達量都呈現下降趨勢。

LcPRDX5在‘井岡紅糯‘懷枝果皮中的表達趨勢與LcMn-SOD在2個品種中對應的表達趨勢完全相同，都是在‘井岡紅糯果皮中起伏式下降，第14天達到峰值，21～28d基本保持不變；在‘懷枝果皮中持續下降后在28d達到峰值后再下降（圖3D）。

3 討論與結論

超氧化物歧化酶（SOD）是重要的抗氧化酶類之一[12]，衰老早期將超氧化物催化分解為基態氧和H2O2[13]，有效清除植物體內的ROS，因此SOD在衰老的整個代謝過程中起著重要的作用[14]。不早衰的玉米品種葉片的SOD活性比早衰的高，說明這個酶在延緩衰老過程中起著重要作用[15]。黃嘌呤氧化酶過量催化產生了過多的O[-2]，產生氧化脅迫引起蝴蝶蘭花的衰老，同時，老花的萼片和花瓣的SOD的活性增大，從而延緩花的衰老[16]。研究荔枝果皮的SOD表達對于研究荔枝果皮采后衰老褐變具有重要意義。

Peroxiredoxins（PRDXs）家族是近期發現的巰基特異性氧化還原酶，是最重要的抗氧化劑之一[17]，在組織細胞中的廣泛分布和高表達，含有保守的Cys基團和相似的功能域，對超氧化合物具有高度親和性[18]。Prdxs催化分解H2O2和脂質過氧化物，清除過多的活性氧[19]。PRDX5作為PRDXs家族的一員，是一種新的不常見的PRDX[20]，有線粒體和過氧化物酶體靶信號，被定性為硫氧還蛋白過氧化物酶[21]，能有效清除植物體內的ROS，在荔枝衰老調控中扮演重要角色。

本研究結果表明，在‘井岡紅糯和‘懷枝低溫貯藏前期，二者的褐變指數上升較緩慢，同時LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的表達量下降，這可能是低溫誘導的條件下，引起荔枝果皮的酶表達下調，荔枝果實的各種代謝緩慢，活性氧的產生受到抑制，褐變緩慢。低溫貯藏的21d內，LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5表達量低的‘井岡紅糯褐變指數也低于表達量高的‘懷枝果皮。這可能是低LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5表達量的‘井岡紅糯有較低的LcLac蛋白和低的總酶活性，因而具有較低的褐變指數。貯藏21d后，4個基因的表達量升高，這可能是荔枝果實對低溫適應后組織代謝積累導致活性氧含量升高引起的。貯藏過程中，‘懷枝的褐變指數始終高于‘井岡紅糯，說明‘井岡紅糯比‘懷枝耐貯；與之對應的LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5表達量也略高于‘井岡紅糯，可能是由于荔枝褐變導致活性氧含量升高，引起LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的高表達，使其編碼的酶的活性升高從而減輕荔枝果皮活性氧積累的壓力。綜合這些結果說明，低溫貯藏過程中，‘井岡紅糯的耐貯性高于‘懷枝，與之對應的LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的表達也高于‘懷枝，但2個品種種4個基因表達的變化趨勢大致相同，LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5與荔枝果皮褐變密切相關。這些結果為進一步研究這些基因在荔枝果皮褐變中的作用提供依據。

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（責編：張宏民）