烏司他丁對(duì)控制性降壓誘導(dǎo)的缺血缺氧腦損傷Caspase—3表達(dá)及凋亡程度

張超城 肖曉山

【摘要】 目的：觀察烏司他丁對(duì)控制性降壓誘導(dǎo)的缺血缺氧腦損傷Caspase-3表達(dá)及凋亡程度。方法：60只新西蘭大白兔隨機(jī)分成5組，每組12只：正常組（Ⅰ組），控制性降壓組（Ⅱ組，平均動(dòng)脈壓降至基礎(chǔ)值的45%組），烏司他丁降壓前給藥組（Ⅲ組，控制性降壓前30min靜注烏司他丁10*104IU/kg），烏司他丁降壓后給藥組（Ⅳ組，控制性降壓開(kāi)始后30min靜注烏司他丁10*104IU/kg），烏司他丁降壓前+降壓后給藥組（Ⅴ組，控制性降壓開(kāi)始前30min和開(kāi)始后30min均靜注烏司他丁10*104IU/kg）。各組在硝普鈉降壓一個(gè)小時(shí)后，停止降壓2小時(shí)后處死，取出海馬組織。TUNEL檢測(cè)海馬凋亡細(xì)胞，用Western-blot檢測(cè)海馬組織casspase-3。結(jié)果：1、Western-blot檢測(cè)：與II組比較，三組用藥組（III、IV、V組）Caspase-3表達(dá)顯著減少（P<0.01）；與III、IV組比較， V組Caspase-3表達(dá)減少（P<0.05）。與II組比較，用藥三組調(diào)亡指數(shù)減少（P<0.01）。2、TUNEL檢測(cè)：與II組、III組、IV組、V組比較，顯示I組調(diào)亡指數(shù)最少的（P<0.01）。與III組、V組比較，顯示IV組的調(diào)亡指數(shù)有所增加（P<0.05）。結(jié)論：1、烏司他丁對(duì)控制性降壓引起腦缺血缺氧腦損傷是有保護(hù)作用，其可能抑制Caspase-3的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)；2、在三組給藥的不同時(shí)段比較中，降壓前+降壓后給藥組（V組）Caspase-3的表達(dá)最少；由此說(shuō)明，推薦的給藥方法是降壓前和降壓后同時(shí)給藥。

【關(guān)鍵詞】烏司他?。豢刂菩越祲?； 缺血缺氧腦損傷； casspase-3

【中圖分類號(hào)】R4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1671-8801（2016）02-0014-02

控制性降壓是在手術(shù)中常用的技術(shù)。同時(shí)控制性降壓也會(huì)帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)，有學(xué)者報(bào)導(dǎo)在控制性降壓出現(xiàn)腦損傷等[1-2]。關(guān)于不同的控制性降壓水平對(duì)兔海馬CA1神經(jīng)元影響的研究[3]結(jié)果顯示MAP降至基礎(chǔ)值的45%，兔海馬CA1神經(jīng)元凋亡程度最嚴(yán)重，因此本研究以MAP降至基礎(chǔ)值45%，以觀察烏司他丁對(duì)控制性降壓誘導(dǎo)的缺血缺氧腦損傷Caspase-3表達(dá)及凋亡程度以指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)新西蘭雄性大白兔，體重1.8-2.2kg。

實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 烏司他丁、TUNEL試劑盒、Caspase-3。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分組及給藥方法 健康新西蘭白兔60只，雄性，體重1.8-2.2Kg，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。60只健康新西蘭白兔，隨機(jī)分成5組，每組12只：正常組（I組），控制性降壓組（II組，平均動(dòng)脈壓[MAP]降至基礎(chǔ)值的45%組），烏司他丁降壓前用藥組（III組，控制性降壓前30min靜脈注射烏司他丁10*104U/kg），烏司他丁降壓后用藥組（IV組，控制性降壓開(kāi)始后30min靜脈注射烏司他丁10*104U/kg），烏司他丁降壓前+降壓后用藥組（V組，控制性降壓開(kāi)始前30min和開(kāi)始后30min均給予靜脈注射烏司他丁10*104U/kg）。

動(dòng)物模型 氯胺酮50 mg/kg復(fù)合1mg/kg力月西肌注麻醉（術(shù)中肌注氯胺酮20 mg/kg/30min）。沿頸中正切開(kāi)，分離氣管，插入氣管導(dǎo)管，接呼吸機(jī)機(jī)械通氣（潮氣量21ml，呼吸51bpm，F(xiàn)iO21.0）。分離頸內(nèi)靜脈、穿刺置管，接延長(zhǎng)管輸液通路并輸液（8ml/kg）。在兔腹股溝下緣分離股動(dòng)脈并穿刺置管，接測(cè)壓轉(zhuǎn)換器并開(kāi)始動(dòng)脈測(cè)壓。正常組采用5%葡萄糖注射液4ml/ （kg*h） 連續(xù)泵注；降壓組及治療組均采用5%葡萄糖液配制的硝普鈉（400ug/ml）開(kāi)始泵注，10-15分鐘內(nèi)降至目標(biāo)血壓，維持目標(biāo)血壓l h。根據(jù)上述分組方案，給予烏司他丁。降壓完畢后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物復(fù)壓2 h后處死。

1.3 標(biāo)本采集與處理 每組動(dòng)物中的一半用于灌注固定：降壓停止后2h，打開(kāi)胸腔暴露心臟，由心尖進(jìn)針插入升主動(dòng)脈（同時(shí)鉗夾腹主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳），快速滴注37℃生理鹽水500ml，無(wú)血污后改為滴注4%多聚甲醛固定液500mL，先在5min內(nèi)灌入約100ml，余液在25分鐘內(nèi)灌完。開(kāi)顱取出1mm及4mm海馬組織，切取右邊1mm3置于4%多聚甲醛液中后固定，剩余組織放置于中性甲醛溶液中固定、梯度乙醇脫水、包埋、切片、撈片、烤片。每組中另外一半動(dòng)物在復(fù)壓2h后處死，迅速取出海馬組織，在-80℃凍存，用于Western Blot檢測(cè)。

1.4 標(biāo)本檢測(cè)方法

1.4.1 Western-blot檢測(cè)Caspase-3的表達(dá)

剪碎組織，與裂解液1：5混合，取上均漿。離心，取上清液；使用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，然后12%SDS-PAGE電泳分離，依m(xù)arker指示，將測(cè)蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜上；封閉液4℃過(guò)夜，抗Caspase-3抗體1：1500稀釋與PVDF膜溫2H，加入二抗，ECL反應(yīng)2min，將蛋白印跡曝光在X光膠片上。結(jié)果使用Gel-Pro Analyzet4.0進(jìn)行分析。以GAPDH為內(nèi)參。

1.4.2 TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞

將冰凍組織切片固定10min，PBS 漂洗10*2min。再置乙醇：乙酸（2：1）溶液-20℃處理5min。PBS 漂洗10*2min。2% H2O2浸泡5min。PBS洗滌10*2min。滴加TdT酶反應(yīng)液，37℃孵育1h（陰性染色對(duì)照，加不含TdT酶的緩沖液替代）。滴加兩滴過(guò)氧化物酶標(biāo)記的地高辛抗體，室溫孵育30min。PBS洗滌10*2min。DAB顯色3～6min。蒸餾水洗5*3min。甲基綠復(fù)染10min。蒸餾水洗5*3min，再用100%正丁醇5*3min。常規(guī)脫水、透明和封片。在400倍光鏡下觀察海馬組織病理學(xué)改變。隨機(jī)選取6個(gè)視野，按照（TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞/神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)）×100%計(jì)算海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行分析。所有計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05，認(rèn)為有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western-blot檢測(cè)Caspase-3的表達(dá)

與控制性降壓組（II組）比較，三組用藥組（III、IV、V組）Caspase-3含量顯著減少（P<0.01）；V組與III、IV比較，顯示V組Caspase-3含量減少（P<0.05）。結(jié)果如下圖：

2.2 TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞

與II組比較，III、IV、V組三組調(diào)亡指數(shù)減少（P<0.01）。II、III、IV、V組與I組比較，P<0.01，顯示正常組調(diào)亡指數(shù)最少的。IV組與III、V組比較，P<0.05，顯示IV組，調(diào)亡指數(shù)有所增加。

3 討論

腦血流有自動(dòng)調(diào)節(jié)功能，但是這種自我調(diào)控功能和耐受性的平均動(dòng)脈壓的安全低限存在明顯的個(gè)體差異。同時(shí)腦的生理特性也是腦缺血缺氧易損傷的原因之一。當(dāng)控制性降壓引腦灌注壓明顯下降時(shí)，極易使腦缺血缺氧而受到損害[4-5]。

腦缺血缺氧會(huì)引起促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。參與凋亡過(guò)程相關(guān)的基因有幾十種，其研究較多的如Bcl-2家族[7]、即早基因[8]、caspase家族[9]等。其中，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分。在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，Caspase-3是最為主要的，在神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著決定性作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)中，Western blot檢測(cè)Caspase-3顯示給藥三組（III組、IV組及V組）與控制性降壓組比較，三組用藥組Caspase-3的含量顯著減少，說(shuō)明用藥后，Caspase-3的表達(dá)是減少的，減輕了神經(jīng)細(xì)胞凋亡反應(yīng)。烏司他丁降壓前+降壓后用藥組Caspase-3的表達(dá)，明顯少量其它用藥二組，說(shuō)明V組烏司他丁的用藥方法更好的抑制Caspase-3的表達(dá)，減輕了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。同時(shí)在凋亡指數(shù)中正常組的神經(jīng)海馬細(xì)胞的凋亡指數(shù)是最少的，而控制性降壓組的凋亡指數(shù)是最嚴(yán)重的。同時(shí)，與控制性降壓組比較，用藥三組凋亡指數(shù)降壓，說(shuō)明烏司他丁有效減輕控制性降壓引起的腦缺血缺氧腦損傷的細(xì)胞凋亡。而用藥三組之間比較顯示，降壓后給藥組細(xì)胞凋亡更嚴(yán)重。說(shuō)明在用藥三組比較，降壓后給藥，神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較多。

綜上所述，烏司他丁對(duì)控制性降壓引起腦缺血缺氧腦損傷是有保護(hù)作用，其可能抑制Caspase-3的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)；在三組給藥的不同時(shí)段比較中，降壓前+降壓后給藥組Caspase-3的表達(dá)最少；由此說(shuō)明，推薦的給藥方法是降壓前和降壓后同時(shí)給藥。

參考文獻(xiàn)：

[1] Mcleod ME，Creighton RE，Humphreys RP.Anaesthetic management of arteriovenous malfol'inations of the vein of Galen.Can Anaesth Soc J，1 982，29（4）：307-3 12.

[2] Pasch T，Huk W.Cerebral complications following induced hypotension.Eur J Anaesthesiol，1 986，3（4）：299-3 12.

[3] Liu B， Zhou D， Huang H， Xiao X. Experimental study on the effect of controlled hypotension levels on rabbit CA1 neurons. J Sur Res， 2013， 182（1）：e15-24.

[4] Jones TH，Chiappa KH，Young RR，et al.EEG monitoring for induced hypotension for surgery of intracranial aneurysms.Stroke，1979，10（3）：292-294.

[5] Pasch T， Huk W.cerebral complications following induced hypotension. Eur J Anaesthesiol，1986，3（4）：299-32.

[6] 石義亭，趙毅，張新東等.腦出血灶周圍組織Bax、Bcl一2的表達(dá)與神經(jīng)元凋亡關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2006，9（2）：4—5.

[7] Linnik M D，Zahos P，Geschwind M D，et al. Expression of bcl-2 from a defective herpes simples virus-1 vector limits neuronal death in focal cerebral ischemia[J].stroke 1995，26（9）：1670-1675.

[8] Jang M H，Shin M C，Lee T H，et al. Acupuncture suppresses ischemia-induced increase in c-Fos expression and apoptosis in the hippocampal CA1 region in gerbils[J].Neurosci Lett，2003，347（1）：5-8.

[9] Shimizu H， Ohgoh M，Ikeda M，et al. Caspase-3-like protease activity-independent apoptosis at the onset of neuronal cell death in the gerbil hippocampus after global ischemia[J].Biol Pharm Bull，2007，30（10）：1950-1953.

[10]YU D，MAO M.ZHOU H，et a1.Pathological changes and apoptosis of brain cells in rat embryo suffering from intrauterine hypoxia—ischemie injury[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2004.35（3）：354—357.