萊姆病診斷方法的研究進展

張少毅

【摘要】萊姆病是一種通過蜱叮咬人、獸傳播的人獸共患病，致病病原體主要是伯氏疏螺旋體，對萊姆病診斷方法的研究將對萊姆病的治療起到指導性作用。

【關鍵詞】萊姆病；伯氏疏螺旋體；檢測

【中圖分類號】R4 【文獻標識碼】A 【文章編號】1671-8801（2016）02-0018-01

1 前言

萊姆病是一種全球性自然疫源性傳染病，人感染伯氏疏螺旋體后主要對人體多系統、多器官造成損害，該病臨床表現呈多樣性，因此容易與其他疾病相混淆，因而實驗室檢驗結果對臨床疾病診斷具有重要的指導意義。目前主要的檢驗方法可分為病原學診斷、特異性抗體及分子生物學檢測。

2 直接檢測

直接檢測即直接分離菌體用BSK培養基培養，生長14天后，暗視野相差顯微鏡觀察其形態，但因其生長緩慢，培養條件高，且長期抗生素治療的慢性病人血培養常為陰性，因此不用于常規臨床診斷。但是如果分離培養出螺旋體，可視為“金標準”[1]。

3 免疫學技術檢測

3. 1間接免疫熒光抗體試驗

伯氏疏螺旋體的表面有大量具有免疫原性的抗原成分，如脂質、蛋白質、脂蛋白、糖類等。伯氏疏螺旋體具有7～11個特征性抗原結構的周鞭毛，含有具有免疫原性的鞭毛素，能夠引起強烈的抗原-抗體反應。在免疫學診斷中萊姆病螺旋體的幾種主要抗原有鞭毛相關蛋白FlaB、鞭毛外鞘蛋白FlaA、OSPC和VlsE[2]。其中鞭毛蛋白FlaB感染萊姆病螺旋體幾天后即可出現強烈的IgM和IgG反應。目前已經建立了很多特異性檢測方法，最常用的是酶聯免疫吸附試驗、酶聯熒光試驗、蛋白印跡法，也有免疫層析法和斑點試驗等。

3.2 ELISA

ELISA實驗是一種間接診斷方法，菌株作為抗原時需要細菌表面能夠表達OspC，同時作為抗原物質的還有DbpA、全細胞抗原、重組抗原和合成抗原。ELISA技術對萊姆病患者IgG和IgM抗體進行檢測，對重組抗原OspC、鞭毛蛋白抗原片段以及全細胞抗原進行比較發現重組抗原檢測敏感性優于全細胞抗原[2]。感染萊姆病的動物臨床癥狀通常容易被忽視，檢測血清抗體對于動物中萊姆病的診斷顯得比較重要，且血清抗體可以在感染動物體內存在數年。

3.3 免疫印跡法

免疫印跡法廣泛應用于血清和血漿中有抗體出現的傳染性疾病的診斷，用免疫印跡法對萊姆病特異性抗體進行檢測，其特異性高于ELISA和IFA。免疫印跡法的結果用特異性條帶來表示，美國建立了兩種診斷標準：IgM蛋白印跡陽性標準是在3條特異帶（OSPC，41kDa或39kDa）中存在2條即可；IgG蛋白印跡陽性標準是在10條特異帶中存在5條即可[3]。近年來有很多研究對免疫印跡法的進一步發展對臨床上萊姆病螺旋體的診斷提供了更加可靠的診斷方法，同時也發現了很多抗體檢測都具有潛在的診斷價值。

3.4 蛋白質芯片技術

過去的十幾年里，DNA芯片技術為全方位的基因研究提供了有力的工具，也在不同的領域發揮著很多作用，同時作為疾病檢測技術引導了生物醫學研究方向的轉變。采用蛋白質芯片技術對不同生理和病理狀態下蛋白質的作用和表達進行分析，這將會加速對生理作用過程和疾病作用機制的理解，找到更有效的疾病治療新策略。有研究[4]用金箔玻璃芯片用N-羥基琥珀酰亞胺進行修飾，通過修飾作用，使蛋白質及多肽側鏈上含有游離氨基基團的氨基酸如賴氨酸，精氨酸等可以通過共價鍵結合到芯片表面，以達到臨床免疫血清檢測的目的。

4 分子生物技術檢測

4.1 常規PCR

普通PCR檢測主要通過檢測患者尿液中伯氏疏螺旋體DNA的陽性率，臨床標本伯氏疏螺旋體DNA檢測的靈敏度差異可能取決于疾病器官表現、病程階段和樣品分析方法，采取患者尿液標本取上清，根據rrf3和rrf5端利用引物設計軟件進行設計引物，再進行PCR擴增， PCR檢測患者尿液伯氏疏螺旋體DNA是診斷萊姆病一個有價值的工具[5]。

4.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR融合了PCR高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確定量等優點，通過直接探測PCR過程中熒光信號的高中低三種熒光信號不同變化來獲得定量的結果，不需要一邊拿PCR的后處理以及電泳檢測，克服了常規PCR技術的一些問題。根據相關基因mRNA表達量的不同對伯氏疏螺旋體可判斷病菌的致病性。

4.3 巢式PCR

在伯氏疏螺旋體的眾多相關基因中，rrf（5S）～rrl（23S）rRNA基因間隔區巢式PCR可用于疑似萊姆病患者血清標本檢測，從病原學角度支持萊姆病的診斷。巢式PCR采用兩對引物，一對引物序列在模板的外側，另一對引物序列在模板的內側，第一對引物的PCR擴增產物作為第二對引物退火的模板，這樣可以使檢測的靈敏度得以提高，而且大大提高了PCR的特異性。

近年來，芯片技術的不斷優化，也為萊姆病的診斷提供了新的方法，能夠針對大樣本和應用微量稀釋抗體和血清進行高通量的檢測，這些都為萊姆病的檢測開拓了更加廣闊的前景。

參考文獻：

[1]李新軍， 張啟恩， 張泮河， 等. 重組伯氏疏螺旋體鞭毛抗原用于萊姆病血清學診斷方法的研究[J]. 中國公共衛生， 2000， 16（11）： 1013-1014.

[2]譚毓繪， 劉勇， 孫荷， 等. 聚合酶鏈法檢測萊姆病患者尿液中伯氏疏螺旋體 DNA （N17 例報道）[J]. 中國臨床神經科學， 2012， 20（4）： 372-376