肢體缺血后處理與缺血預處理對孕兔失血性休克肝損傷保護作用的比較研究*

曾晶晶，李嵩山，吳　明，馮永文

(深圳市第二人民醫院深圳大學第一附屬醫院a．重癥醫學科; b．麻醉科，廣東　深圳　518035)

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肢體缺血后處理與缺血預處理對孕兔失血性休克肝損傷保護作用的比較研究*

曾晶晶a，李嵩山b，吳明a，馮永文a

(深圳市第二人民醫院深圳大學第一附屬醫院a．重癥醫學科; b．麻醉科，廣東深圳518035)

摘要:目的:比較肢體缺血后處理和肢體缺血預處理對孕兔失血性休克肝損傷保護作用的影響。方法:將32只孕兔隨機分為4組:假手術組(S組)、缺血再灌注組(IR組)、肢體缺血后處理組(LRIP組)和肢體缺血預處理組(LIPC組)，每組實驗動物均行雙側股動脈游離。S組:只對雙側股動脈游離; IR組:孕兔股動脈放血，維持平均動脈壓40 mmHg 3 h后，1 h內勻速回輸全部血液，使孕兔血壓維持在MAP穩定在80 mmHg之上并平穩24 h; LRIP 組:孕兔股動脈放血3 h后，給予缺血后處理即夾閉雙側股動脈，進行10次缺血30 s再灌注30 s，再輸血復蘇至24 h。LIPC組:手術前24 h，重復3次采用壓脈帶捆扎兔單側后肢5 min，直至后肢皮膚呈紫色、股動脈搏動消失、隨后開放5 min，再行IR處理。24 h后觀察血清中ALT、AST的變化，對肝組織MDA、SOD、NO及NOS的含量進行檢測，ELISA法測定不同時點血清TNF-α、IL-10的含量，HE染色法進行肝組織病理學檢查。結果: (1)與I/R組相比，LRIP組及LIPC組的肝組織SOD、NO、NOS含量則顯著升高(P＜0．01)，而MDA含量明顯降低(P＜0．01) ; (2)血清TNF-α含量降低、IL-10含量升高; (3)同時肝組織病理形態學損傷亦明顯減輕，而LRIP組與LIPC組相比無顯著性差異(P＞0．05)。結論:重復10次缺血30 s再灌注30 s的肢體后處理和手術前24 h重復3次對兔單側后肢捆扎5 min、開放5 min缺血再灌注的肢體預處理，對肝臟功能具有保護作用，其機制可能與促進一氧化氮的生物學作用發揮保護效應、減少iNOS的表達、抑制再灌注后氧自由基的過量生成、改善肝臟內炎癥反應有關。缺血后處理與缺血預處理對肝臟都有顯著性的保護作用，但是彼此差異不顯著。

關鍵詞:肢體缺血后處理;肢體缺血預處理;失血性休克;肝損傷;一氧化氮合酶

在臨床上，嚴重創傷、產后大出血常引發失血性休克，在休克早期，肝臟、腎臟和腸道等器官易發生功能性障礙，采用早期復蘇的方法可有效降低其缺血性損害，而中后期的復蘇則易造成器官的再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)［1］。缺血再灌注損傷會加重組織和器官結構性損傷，無法達到其功能性恢復的目的。目前的研究結果表明，肢體缺血后處理［2］(Limb remote ischaemic postconditioning，LRIP)和肢體缺血預處理(Limb ischemic preconditioning，LIPC)對心和腦的再灌注損傷具有一定的保護作用［3－6］。在國內外文獻中通過肢體缺血處理對肝臟損傷的研究很少。因此，本文以急性失血性休克孕兔為動物模型，通過比較LRIP和LIPC對孕兔失血性休克肝臟再灌注損傷的保護作用的差異，探討其可能的機制。

1　材料和方法

1．1實驗材料新西蘭孕兔32只購于南方醫院動物中心(實驗地點使用許可證號SYXK(粵2010-0143)，動物生產許可證號: SCXK(粵2011-0069)，生理年齡1～2歲，妊娠時間20～30天，體重2．65～4．62 kg;谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)分型試劑盒(丹麥DAKO公司，貨號K4376/Z9537/W5600/H3421/H6271)。兔TNF-α、IL-10的ELISA試劑盒(北京晶美科技有限公司，貨號27694-53-8/37634-75-2)。

1．2方法

1．2．1動物分組與模型制備

1．2．1．1動物分組喂養孕兔3 d，使適應環境后隨機分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(IR 組)、肢體缺血后處理組(LRIP組)、肢體缺血預處理組(LIPC組) 4組，每組8只。術前禁食12 h，自由飲水。

1．2．1．2建立模型建立孕兔失血性休克模型［7］。腹腔注射麻醉10%的水合氯醛3 mL·kg－1，麻醉后，雙側股動脈游離，連接動脈導管壓力轉換器，控制性放血制備失血性休克及實時監測血壓。S組:只對雙側股動脈游離; IR組:孕兔股動脈放血，維持平均動脈壓40 mmHg 3 h后，1 h內勻速回輸全部血液，使孕兔血壓維持在MAP穩定在80 mmHg之上并平穩24 h; LRIP組:孕兔股動脈放血3 h后，給予缺血后處理即夾閉雙側股動脈，進行10次缺血30 s再灌注30 s，再輸血復蘇至24 h。LIPC組:手術前24 h，重復3次采用壓脈帶捆扎兔單側后肢5 min，直至后肢皮膚呈紫色、股動脈搏動消失、隨后開放5 min，再行IR處理。

1．2．2生化指標檢測測定血清谷丙轉氨酶(ALT)及谷草轉氨酶(AST)的含量:恢復肝臟血流24 h后，經股動脈取血3 mL，常溫1 600 r·min－1離心5 min，全自動生化分析儀測定血清中ALT與AST的含量。

1．2．3 ELISA法測定TNF-α、IL-10含量于復蘇即刻(T1: 0 h)、復蘇后(T2: 8 h)、復蘇后(T3: 16 h)、復蘇后(T4: 24 h)在麻醉下于股動脈采血3 mL，離心后，測定血清中TNF-α、IL-10不同時點(0 h、8 h、16 h、24 h)的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1．2．4組織SOD、MDA、NO、NOS含量的測定恢復肝臟血流24 h后，剪取孕兔左葉新鮮肝組織150 mg，將其制備成10%肝組織勻漿，4℃5 000 r ·min－1離心5 min，之后取上清液依照試劑盒具體操作測定SOD，MDA，NO，NOS。

1．2．5標本采集及處理24 h后，處死孕兔，切取新鮮左葉肝組織，用質量濃度為100 g·L－1的甲醛溶液固定24 h，常規石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡觀察。

1．3統計學處理用均數±標準差(MEAN±SD)表示實驗所得數據，采用Graphpad prism 5軟件進行t檢驗和χ2檢驗。P＜0．05為有統計學差異。

2　結果

2．1血清ALT及AST含量變化與S組比較，IR、LRIP、LIPC組血清ALT及AST含量迅速升高，均具有極顯著性差異(P＜0．01) ;與IR組相比，LRIP、LIPC組各指標水平明顯下降，亦具有顯著性差異(P ＜0．05)，但LRIP與LIPC組相比，尚無顯著性差異(P＞0．05)見表1。說明急性失血性休克能夠造成孕兔肝功能受損，經過后處理和預處理，能夠顯著性的改善肝臟受損程度。

表1兔肝組織中各組肝功能指標的變化比較/U·L－1，mean±sd

2．2兩組缺血處理干預后對孕兔TNF-α、IL-10的變化影響通過圖1、2可以看出，與S組相比，IR組、LRIP組和LIPC組TNF-α、IL-10含量在0 h、8 h、16 h均有上升，差異顯著(P＜0．05)，與IR組相比，LRIP組和LIPC組TNF-α含量在各時點均降低，差異有統計學意義(P＜0．05)，LRIP組和LIPC組的IL-10含量在0 h、8 h、16 h時均升高，差異有統計學意義(P＜0．05)。說明孕兔經肢體缺血后和肢體缺血預處理24 h后，肝臟內炎癥反應有極為明顯的減輕。經過肢體缺血后處理與肢體缺血預處理干預后，孕兔血清TNF-α、IL-10的變化影響如圖1、2所示。

圖1　肢體缺血后處理和缺血預處理在不同時間點對孕兔失血性休克血清TNF-α含量影響

圖2　肢體缺血后處理和缺血預處理在不同時間點對孕兔失血性休克血清IL-10含量的影響

2．3肝組織SOD、MDA、NO、NOS含量變化3 h失血，經過再灌注后，與S組相比，肝組織IR、LRIP、LIPC組中SOD、NO、NOS含量明顯降低，而MDA水平則明顯升高，差異均具有顯著性(P＜0．01) ;與IR組相比，LRIP、LIPC組的SOD、NO、NOS水平上升，而MDA含量下降，差異亦具有顯著性(P＜0．01)，LRIP、LIPC組無顯著性(P＞0．05)見表2、表3。

表2各組兔肝組織中SOD及MDA的含量變化/mean±sd

表3　各組兔肝組織中NO及NOS的含量變化/mean±sd

2．4肝組織病理形態學改變通過光學顯微鏡觀察，S組的肝細胞飽滿，細胞核規則，能夠較為明顯的觀察到肝細胞的形態結構，肝小葉和肝竇以及毛細血管正常; IR組可見肝細胞皺縮，細胞核溢出，毛細血管有微栓子形成，有較多細胞破裂，肝竇也有紅細胞大量淤積;與IR組相比，LRIP組和LIPC組肝小葉結構基本完整，毛細血管中無微栓子形成，肝細胞形態結構破壞程度低，能夠較為明顯的觀測出細胞的形態結構; LRIP組和LIPC組的HE染色細胞形態結構較為接近(見圖3)。

圖3　不同組孕兔肝組織病理形態學變化

3　討論

肢體缺血后處理是指在缺血再灌注早期，通過反復、短暫的缺血及恢復血流可達到保護組織的效果［8－11］。這種處理方式能增加其對隨后缺血的耐受性［12－13］，在多種動物和臟器中被證實了這一機體的內源性保護作用［14－16］。近年來，大量實驗已經證明肢體缺血后處理及肢體缺血預處理對肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用。通過HE的病理學染色，與S組進行組織學的比較，文中圖3結果顯示，孕兔休克性失血模型的建立能夠造成肝臟功能尤其是肝細胞的損害。

3．1肢體缺血后處理與肢體缺血預處理能減少肝細胞破壞，改善肝功能血清中ALT變化直接反映肝細胞的破壞程度，進而反映肝臟功能的變化。本研究通過監測血清中ALT、AST的變化，研究不同處理方案對肝功能的影響。結果顯示，孕兔失血性休克3 h之后，肝臟即出現低灌注損傷。IR組與sham組相比，血清中ALT含量顯著增高，表明孕兔失血性休克可導致肝細胞損害。予以不同的處理后，LRIP和LIPC組處理中的ALT和AST含量明顯降低，表明肢體缺血后處理和肢體缺血預處理都能夠減少肝細胞的破壞程度，改善肝功能。

3．2肢體缺血后處理與肢體缺血預處理能夠抑制炎癥反應在孕兔急性失血性休克過程中，會導致肝臟、腎臟等多器官的缺血再灌注損傷。臟器發生缺血再灌注損傷的機制在目前已經研究的較為清楚，包括炎癥因子的參與，例如炎癥細胞對周圍組織的浸潤、活化，鈣超載、氧自由基的產生等等，失血性導致的肝缺血再灌注損傷與巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞等免疫細胞介導的自身免疫系統密切相關，其中巨噬細胞在其中對周圍組織的浸潤尤為嚴重。在缺血過程中，能夠激活中性粒細胞，造成周圍組織釋放更多的炎癥因子，包括白細胞介素(IL-8)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等等。

本實驗結果顯示，S組TNF-α及IL-10的含量在任何時間點都沒有顯著的改變，IR、LRIP組、LIPC組的血清TNF-α均在8 h最高、IL-10均在16 h最高，后再次下降;與S組相比，IR組在各時間點的TNF-α、IL-10含量有顯著性升高(P＜0．05)，與IR組相比，LRIP組和LIPC組在各時間點的TNF-α、IL-10含量則有所下調。根據實驗結果推斷肢體缺血后處理與肢體缺血預處理減少肝臟損傷可能的途徑是通過抑制中性粒細胞在組織器官的聚積和細胞因子(TNF-α和IL-6)的釋放來減輕組織缺血再灌注損傷的程度［17］。說明LRIP和LIPC可以改善肝內炎癥反應，調節巨噬細胞生存的微環境，保護肝功能。因為中性粒細胞CD11/CD18的表達能夠通過TNF-α增強，所以也能夠促進中性粒細胞對周圍細胞和組織的滲出與粘附。

3．3肢體缺血后處理與肢體缺血預處理能夠抑制氧自由基產生以及促進NO的生物學作用本文實驗結果顯示，與S組相比，肝組織IR、LRIP、LIPC組中SOD、NO、NOS含量明顯降低，而MDA水平則明顯升高;與IR組相比，LRIP、LIPC組的SOD、NO、NOS水平上升，而MDA含量下降，這說明缺血后，氧自由基大量產生，對肝臟的功能會有較強的損害，而肢體缺血后處理和肢體缺血預處理可通過對這些細胞因子和氧自由基的產生，同時加強NO的生物學功能，進而降低肝臟缺血再灌注時的損傷。活性氧(ROS)在缺血再灌注損傷時程度的減輕發揮著重要作用［18］。ROS是在缺血后產生的，與丙二醛水平的上升有密切關系。肢體缺血后處理和預處理能通過減少超氧自由基的生成來保護組織，與減少脂類氧化產物(MDA)相關。

孫凱［19－20］等人在肢體缺血后處理的研究中，發現氧自由基的大量產生能夠對周圍組織和細胞進行破壞，抑制氧自由基過量產生能夠改善微環境，對缺血再灌注損傷能夠起到減輕的作用，同時NO能夠降低巨噬細胞的浸潤和粘附，減少缺血對內皮細胞和周圍組織造成的損傷，本實驗觀察到的結果與此結論相符。

綜上所述，肢體后處理與預處理對孕兔失血性休克的肝臟缺血再灌注損傷同樣具有保護作用，在病程中，兩者治療手段相輔相成。肢體缺血預處理能夠在較早時間內預防病情的產生，同時能夠減少肝功能的損害，一旦形成損傷，預處理治療的最佳時間失去，而肢體缺血后處理能夠發揮至關重要的作用，正好彌補預處理在治療缺血再灌注損傷上的不足，具有良好的應用前景。

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A Comparative Study of Protective Effect of Limb Ischemia Postconditioning with Limb Ischemia Preconditioning on Liver Injury in Pregnant Rabbits with Hemorrhagic Shock

ZENG Jing-jing1，LI Song-shan2，WU Ming1，FENG Yong-wen1
(1．Dept．of ICU; 2．Dept．of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Shenzhen University，Shenzhen，Guangdong 518035)

Abstract:objective: To compare the protective effect of the Limb ischemia post-processing with Limb ischemic preprocessing on liver injury in pregnant rabbits with hemorrhagic shock．Methods: 32 pregnant rabbits were randomly divided into 4 groups: sham operation group(S)，ischemia reperfusion group(IR)，limb remote ischemia post-processing group (LRIP) and limb ischemic preconditioning group(LIPC)．Each group of experimental animals was treated by bilateral femoral artery dissociation．S group was treated only by bilateral femoral artery dissociated．In IR group，the femoral arteries of the pregnant rabbits were bleeded．maintaining the mean arterial pressure 40 mmHg for 3 hours，then all the blood lost were transfused back at a conctant speed within one hour．The blood pressure of pregnant rabbits was maintained at MAP，being above 80 mmHg stable for 24 hours．In LRIP group，the femoral arteries of the pregnant rabbits were bleeded for 3 hours，given ischemia post-processing，which was clamping bilateral femoral artery，ischemia for 30 s and reperfusion for 30 s for 10 times，and recovered by blood transfusion for 24 hours．In LIPC group，24 hours beforebook=32,ebook=39the surgery，the unilateral hind limbs of rabbits were tied up with the pressure pulse band for 5 min for 3 times until the skin of the hind legs was purple and the femoral artery pulse was disappeared．Subsequently the band was removed for 5 minutes，then the IR processing was employed．24 hours later，the change of ALT，AST in serum were observed; the content of MDA，NO，SOD and NOS of the hepatic tissue were detected; the contents of TNF-α and IL-10 in different points in serum were detected by ELISA method．Pathological examination of liver tissue were employ by HE staining method．Results: (1) Compared with IR group，the content of MDA，NO，SOD and NOS of the hepatic tissues of LRIP group and LIPC group were increased obviously (P＜0．01)，but the MDA contents obviously decreased(P＜0．01) ; (2) In serum，TNF-α contents decreased and IL-10 contents increased; (3) At the same time，the pathological damages of liver tissue were significantly reduced，and there was no significant difference between LRIP group and LIPC group (P＞0．05)．Conclusion: To repeat 10 times 30s reperfusion for 30 s for limb post-processing and to repeat it 3 times on unilateral hind limb of rabbits 24 hours before surgery，with being tied up for 5 minutes and being undone for 5 minutes in ischemia reperfusion for Limb preprocessing，have protective effect on liver function．The mechanism may be related to promoting biological effects of nitric oxide to play a protective effect，reducing the expression of iNOS，inhibiting excessive generation of oxygen free radicals after reperfusion，improving liver inflammation．Both the Ischemia postconditioninging and the Ischemia preconditioning have a significant protective effect，but the difference was not significant．

Key words:limb ischemic postconditioning; limb ischemia preconditioning; hemorrhagic shock; Liver injury; Nitric oxide synthase

(收稿日期:2015－10－14) (責任編輯:敖慧斌)

通訊作者:馮永文，男，醫學碩士，主任醫師，研究方向:多器官功能障礙的研究。E-mail: jingjing064@ aliyun．com

*基金項目:深圳市科技計劃項目(201102047)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．008

中圖分類號:R605．971

文獻標志碼:A

文章編號:1001－5779(2016) 01－0031－06