白藜蘆醇調控大鼠心力衰竭模型氧化應激相關基因的作用

陳　玨，於　悅，高　想，蔣鳳榮

1.江蘇省南通市中醫院(江蘇南通 226001)；2.南京中醫藥大學

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白藜蘆醇調控大鼠心力衰竭模型氧化應激相關基因的作用

陳玨1，於悅1，高想1，蔣鳳榮2

1.江蘇省南通市中醫院(江蘇南通 226001)；2.南京中醫藥大學

摘要：目的探討白藜蘆醇調控大鼠心力衰竭模型氧化應激相關基因的作用。方法 采用腹主動脈縮窄法制備SD大鼠心力衰竭模型，測定心臟重量指數變化， Real-Time PCR定量分析超氧化物歧化酶(SOD)、血紅素氧合酶(HO-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)表達；免疫組織化學法檢測SOD。結果白藜蘆醇干預組和模型組比較，心臟重量指數改善，高劑量組更為顯著；心衰大鼠SOD、GPx、 HO-1表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，白藜蘆醇干預后，SOD、GPx、 HO-1表達水平均有所升高，其中以SOD改善明顯(P<0.0 5)，高劑量組SOD表達甚至高過假手術組。結論 白藜蘆醇能提高大鼠心力衰竭模型心肌各氧化相關基因的表達，改善心功能。

關鍵詞：心力衰竭；白藜蘆醇；氧化應激；大鼠；超氧化物歧化酶；血紅素氧合酶；谷胱甘肽過氧化物

腎素-血管緊張素-醛固酮(RAS)系統的激活，導致心室重塑，是心力衰竭(心衰)發生和發展的基本機制。越來越多的證據顯示，氧化應激在其中起著重要作用[1]。本研究采用腹主動脈縮窄法建立SD大鼠心衰模型，加入白藜蘆醇(resveratrol ，RES)進行干預，定量分析氧化應激相關基因，旨在探討白藜蘆醇對大鼠心衰模型氧化應激的作用。

1材料與方法

1.1藥品與試劑白藜蘆醇，由天津市尖峰天然產物研究開發有限公司生產，純度>98%，抗體(SOD一抗，二抗IGG)由美國B&R公司提供，引物和生物試劑盒(SOD、HO-1)由南京生物工程有限公司提供，其他化學試劑均為分析純。

1.2實驗動物及造模SD大鼠24只，雄性，體重(220±10)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[許可證號：SCXK(滬)2007-0005]。參照文獻[2]采用腹主動脈縮窄法制備心臟壓力負荷超載心力衰竭模型。2%戊巴比妥鈉按30 mg/kg進行腹腔麻醉，剪毛，開腹并分離暴露腹主動脈，在雙側腎動脈間分離該處腹主動脈，將直徑0.6 mm的針灸針與腹主動脈平行，1號線結扎固定，拔出針灸針，造成腹主動脈縮窄，依次縫合肌層和皮膚，術后每日腹腔注射0.1 mL慶大霉素預防感染。

1.3實驗分組假手術組除開腹暴露、分離雙側腎動脈間腹主動脈但不行縮窄處理外，其余步驟與模型組一致。24只大鼠隨機分為模型組、假手術組和RES低劑量組、RES高劑量組，各組6只，所有動物常規喂養。實驗在南京中醫藥大學實驗動物中心進行[許可證號：SYXK(蘇)2005-0009]。

1.4給藥方法假手術組：手術分離腹主動脈，不進行縮窄處理，手術4周后雙蒸水灌胃，1次/日，連續4周。模型組：造模4周后，雙蒸水灌胃，1次/日，連續4周。RES低劑量組(低劑量組)：造模4周后，RES10 mg/kg，1次/日，用雙蒸水稀釋后灌胃，連續4周。RES高劑量組(高劑量組)：造模4周后， RES40 mg/kg，1次/日，用雙蒸水稀釋后灌胃，連續4周。

1.5心臟重量指數(HWI)測定沿主動脈根部游離心臟，剔除大血管殘端、筋膜及脂肪組織。測定心臟重量，計算HWI(HWI=心臟重量/動物體重)。

1.6Real-Time PCR定量分析氧化相關基因超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、血紅素氧合酶(HO-1)表達水平。用Trizol試劑抽提細胞總RNA，取2 μg RNA逆轉錄制備cDNA。Real-Time PCR反應體系包括1 μL的cDNA模板(1%的RT產物)、7.5 μL SYBR Green Mix(Takara)及10 μmol/L終濃度的上、下游引物(SOD的上游引物：5′-CAAGCGGTGAACCAGTTGTG-3′，下游引物：5′-TGAGGTCCTGCACTGGTAC-3′；GPx的上游引物：5′CCTCAAGTACGTCCGACCAG 3′，下游引物：5′TTCCATGCGATGTCATTGCG3′；HO-1的上游引物：5 ′-GAATTCAGCATGCCCCAGGATTTG-3′，下游引物：5′-TCTAGACTAGCTGGATGTTGAGCAGGA-3′)，加入H2O補足15 μL，擴增條件為95℃ 5 s總變性以及95℃ 5 s、 60 ℃ 31 s循環40次。目的基因的mRNA水平用β-actin(上游引物：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAAC-3′、下游引物：5′-TTCATCTTCATGGTGCTAGGA-3′)內參校正，并將假手術組細胞的表達水平設定為1。所有樣品每個基因的PCR反應均為3孔，實驗重復至少3次。

1.7免疫組織化學法檢測SOD心肌組織常規切片，脫蠟、脫水后，用3%過氧化氫阻斷內源性的過氧化物酶；PBS沖洗，小牛白蛋白封閉；加入一抗4℃過夜；PBS沖洗，加入二抗室溫40 min，PBS沖洗，加入DAB顯色，蘇木素淡染，鏡下觀察。主要SOD為細胞質呈棕黃色顆粒。

2結果

2.1心臟重量指數模型組與假手術組相比，大鼠心臟重量指數明顯增加，RES干預組心臟重量指數低于模型組，且高劑量組對心臟重量指數的改善優于低劑量組。詳見圖1。

圖1各組大鼠心臟重量指數比較

2.2各組大鼠氧化應激指標比較與假手術組比較，模型組、低劑量組、高劑量組HO-1及GPx指標均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，模型組SOD水平明顯低于假手術組，而低劑量RES組、高劑量RES組表達較假手術組無明顯增減(P>0.05)，高劑量組SOD表達甚至高于假手術高組水平；與模型組比較，低劑量組、高劑量組各項指標均有所升高，其中SOD、HO-1表達增強(P<0.05)，GPx表達有增強趨勢(P>0.05)。詳圖2。

圖2各組大鼠氧化應激指標比較

2.3各組大鼠SOD比較免疫組織化學檢測(SP法，×200倍)假手術組心肌細胞質中見一定量的棕黃色顆粒，模型組中棕黃色顆粒明顯減少，低劑量組和高劑量組棕黃色染色明顯增多，以高劑量組棕黃色顆粒最為明顯。

3討論

心力衰竭指各種心臟結構和(或)功能性疾病導致心室的充盈及(或)射血能力受損的一種復雜的臨床綜合征，是大多數心血管疾病的最終歸宿[2]。心腦血管疾病與癌癥業已成為我國慢性病病人的兩大最主要死亡原因[3]。一個多世紀以來，人們對心衰發病機制的認識經歷了體液潴留、血流動力學異常、神經激素異常及心室重塑等不同階段[4]。目前普遍認為心室重構是心衰發生發展的核心基礎，而氧自由基可損傷心肌細胞膜，改變離子通道，促進膠原合成，加劇心肌細胞損傷和心肌纖維化，進而促進心室重構。因此，抑制心室重構、減輕氧化應激反應，理論上可延緩慢性心衰病的發展。

白藜蘆醇化學名為3，4，5三羥基-1，2二苯乙烯，屬于非黃酮類多酚化合物，因具有心血管保護作用而備受關注[5-9]。天然白藜蘆醇廣泛存在于葡萄、花生等植物中，是植物抗紫外線照射和真菌感染等不利因素產生的一種防御素。并可在虎杖、決明子等中藥中提取獲得。藥理學研究證實虎杖具有擴張血管、改善微循環的擴血管作用；虎杖水煎液對離體心臟的收縮具有明顯的增強作用，可能與Ca2+、α受體、β受體有關。虎杖不僅能提高心肌對缺氧的耐受能力，而且對缺氧心肌有保護作用，究其原因，可能與含有白藜蘆醇相關[10]。近年的研究表明，白藜蘆醇心血管保護作用是通過多靶點多途徑來實現的，如抗細胞凋亡，抗血小板凝集、抗低密度脂蛋白氧化，減少心肌缺血及再灌注損傷等。

心臟壓力負荷過重是引起心肌肥厚及最終導致心衰的主要原因之一。腹主動脈血管阻力上升直接導致左心室后負荷增加，進而刺激心肌細胞肥大并伴心肌纖維間質增生，室壁增厚，出現心肌肥厚。本實驗通過結扎大鼠腹主動脈造成壓力超負荷心肌肥厚模型，結果顯示，模型大鼠心重指數高于假手術組，而白藜蘆醇干預組可降低心重指數，且高劑量白藜蘆醇組改善心重指數的程度優于低劑量組，說明白藜蘆醇能有效降低心肌肥厚小鼠的心重指數，對心肌肥厚的發生發展有一定緩解作用。

氧化應激是指體內氧化防御體系受損和活性氧(ROS)過量生成，從而導致潛在性損傷的病理過程[11]。本研究結果顯示，心衰模型大鼠氧自由基清除酶SOD、HO-1、GPX均呈現活性下降，說明充血性心力衰竭時機體的抗氧化能力減弱，機體處于相當強的氧化應激狀態。白藜蘆醇干預后上述氧自由基清除酶活性提高，且和白藜蘆醇劑量呈正比，表明白藜蘆醇通過調控氧化應激相關基因，抑制心衰模型的氧化應激狀態，改善心功能，可能是白藜蘆醇對心血管保護作用的重要機制之一。

現階段心力衰竭的治療以抑制神經內分泌的激活為主流，療效尚不能令人滿意。本研究結果提示，抗氧化應激可能成為心衰治療新的靶點，并為中藥干預心衰的機制提供思路和依據。其作用的分子信號通路尚需進一步研究。

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(本文編輯王雅潔)

The Influence of Resveratrol on the Myocardial Oxidation Related Genes in Rat Models with Heart Failure

Chen Jue，Yu Yue，Gao Xiang，Jiang Fengrong

Nantong Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nantong 226001，Jiangsu，China Corresponding Author：Gao Xiang

Abstract：Objective To observe the effect of resveratrol(RES) on the myocardial oxidation related genes in rat models with heart failure(HF).MethodsSprague-Dawley (SD) rat models with HF were established by partially banding abdominal aortic artery.The cardiac fibrosis was evaluated by heart weight index(HWI).The expression of superoxide dismutase (SOD 1)，heme oxygenase (HO-1)，glutathione peroxidase (GPX) were measured by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).SOD was detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with model group，HWI was significantly increased in RES group，especially RES high dose group.The expression levels of SOD1，GPx，HO-1 were decreased in model group(P<0.01 or P<0.05).The expression levels of SOD1，GPx，HO-1 were increased in RES group(P<0.05)， especially SOD.The activity of SOD in RES high dose group was higher than that in sham operation group.ConclusionRES can improve the expression of the myocardial oxidation related genes in rats with heart failure.

Key words：heart failure；resveratrol；oxidative stress；rat；Superoxide dismutase；heme oxygenase；glutathione peroxidase

(收稿日期：2016-02-02)

中圖分類號：R541R289

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.07.011

文章編號：1672-1349(2016)07-0704-003

通訊作者：高想， E-mail：ntgx1964@163.com

基金項目：江蘇省南通市人才工作專項基金(No.s8008)