雄激素受體、磷酸化蛋白激酶B在三陰性乳腺癌中的表達及意義

鄒偉 朱淑玲 蔡方

[摘要] 目的 探討雄激素受體（AR）、磷酸化蛋白激酶B（P-PKB）在三陰性乳腺癌中的表達及意義。 方法 收集2012年3月～2015年3月惠州市中心人民醫院收治的乳腺癌患者115例，其中三陰性乳腺癌54例，非三陰性乳腺癌61例。采用免疫組化S-P法檢測AR、P-PKB表達。比較三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌AR、P-PKB表達陽性率，分析三陰性乳腺癌組織中AR和P-PKB表達與臨床病理參數的關系。 結果 三陰性乳腺癌AR陽性表達率明顯低于非三陰性乳腺癌（P < 0.05）；三陰性乳腺癌P-PKB陽性表達率明顯高于非三陰性乳腺癌（P < 0.05）；三陰性乳腺癌組織中AR的表達與臨床分期和淋巴結轉移情況呈顯著負相關（r = -0.295、-0.311，P < 0.05）；三陰性乳腺癌組織中P-PKB的表達與臨床分期和淋巴結轉移情況呈顯著正相關（r = 0.332、0.329，P < 0.05）。 結論 AR、P-PKB在三陰性乳腺癌的表達具有重要的意義，可以作為預后的重要指標，并有望成為未來治療三陰性乳腺癌的新靶點。

[關鍵詞] 雄激素受體；磷酸化蛋白激酶B；三陰性乳腺癌；表達

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（b）-0124-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of androgen receptor （AR） and phosphorylated protein kinase B （P-PKB） in triple negative breast cancer. Methods From March 2012 to March 2015， in Central People's Hospital of Huizhou City， 115 patients with breast cancer were selected， among them， 54 cases were triple negative breast cancer， 61 cases were non-triple negative breast cancer. The expression of AR and P-PKB was detected by immunohistochemistry S-P method. The expression of AR， P-PKB， and AR in triple negative breast cancer and triple negative breast cancer tissues were compared， and the relationship between the expression of P-PKB and the clinicopathological parameters were analyzed. Results AR positive expression rate of triple negative breast cancer was significantly lower than non-triple negative breast cancer （P < 0.05）； P-PKB positive expression rate of triple negative breast cancer was significantly higher than non triple negative breast cancer （P < 0.05）； AR expression of triple negative breast cancer tissues had a significantly negative correlation with clinical stage and lymph node metastasis（r = -0.295， -0.311， P < 0.05）； P-PKB expression of triple negative breast cancer tissues had a significantly positive correlation with clinical stage and lymph node metastasis（r = 0.332， 0.329， P < 0.05）. Conclusion AR， P-PKB expression have a great significance in triple negative breast cancer， can be used as an important indicator of prognosis， and they are expected to become new targets in treatment of triple negative breast cancer.

[Key words] Androgen receptor； Phosphorylated protein kinase B； Triple negative breast cancer； Expression

三陰性乳腺癌是指孕激素受體（PR）陰性、雌激素受體（ER）陰性以及人類表皮生長因子受體2（HER2）低表達的乳腺癌，是一種被認為獨立的臨床病理類型，其占乳腺癌的15%～20%[1]。相比其他類型乳腺癌，三陰性乳腺癌預后性差，腫瘤分級高，且更容易復發[2-3]。靶向治療及內分泌治療對三陰性乳腺癌的治療效果差，目前，放化療是其主要治療手段，但是治療效果仍然不太理想[4]，因此，三陰性乳腺癌臨床治療方案的制訂一直是臨床醫師的重大挑戰。雄激素是性激素的一種，雄激素受體（AR）及其配體雄激素在乳腺生物學上及致癌作用上扮演重要角色[5]。蛋白激酶B（PKB）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種信號轉導蛋白，磷酸化蛋白激酶B（P-PKB）即活化的PKB，其在促進細胞異常繁殖分化、促進癌癥的發生發展中扮演重要角色[6]。基于以上分析，本研究通過分析三陰乳腺癌患者與非三陰乳腺癌患者及三陰乳腺癌不同分期患者間的AR、P-PKB的表達情況，以探討AR、P-PKB在三陰性乳腺癌的表達意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年3月～2015年3月惠州市中心人民醫院（以下簡稱“我院”）收治的三陰性乳腺癌患者54例，均經病理學檢查以及免疫組化染色確認，以ER、PR陰性及HER2低表達定義為三陰性乳腺癌。所有患者均為女性，年齡30～75歲，平均（52.34±8.93）歲；臨床分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期29例，Ⅲ期18例；腫瘤≥5 cm 8例，<5 cm 46例；淋巴結陽性29例，淋巴結陰性25例。同時選擇我院同期收治的非三陰性乳腺癌61例，年齡28～74歲，平均（51.49±9.42）歲；臨床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期31例，Ⅲ期15例；腫瘤≥5 cm 3例，腫瘤<5 cm 51例；淋巴結陽性24例，淋巴結陰性30例。兩組患者年齡、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結轉移情況等一般資料比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 納入標準及排除標準

納入標準：①有完整的臨床資料，包括一般情況、治療方式、腫瘤大小、病理診斷等；②未行新輔助化療；③簽屬知情同意書者。

排除標準：①入院時生命體征不平穩患者；②遠處臟器轉移者；③攜帶肝炎病毒患者，或嚴重肝、腎等臟器功能不全患者；④合并其他惡性腫瘤者；⑤手術禁忌或過敏體質者。

1.3 主要儀器與試劑

石蠟切片機（Thermo Shandon Ltd.，Finesse E型號），顯微鏡（上海彼愛姆，XSP-BM-2CB型號），離心機（山東博科生產，BK-TDZ5型號），免疫組織修復盒（北京馳明瑞生物科技有限公司，18孔規格），蛋白激酶B多克隆抗體（上海鈺博公司，1 mg/mL），雄激素受體（AR）多克隆抗體（上海鈺博公司，1 mg/mL），自制PBS緩沖液，自制檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），自制0.3%過氧化氫溶液等。

1.4 檢測方法

采用免疫組化S-P法檢測AR、P-PKB表達，嚴格根據試劑盒說明書標準進行操作。對115份包埋腫瘤石蠟塊進行連續切片，每張切片厚度為4 μm，置于60℃烤箱中石蠟包埋切片脫蠟（烤箱內放置120 min），切片脫蠟置水，采用檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）進行抗原修復，將其于過氧化氫溶液（濃度為0.3%）中浸入10 min，阻斷內源化過氧化氫酶的活性，然后再采用10%正常血清封閉，放置于室溫孵育10 min，滴加雄激素受體（AR）多克隆抗體、蛋白激酶B多克隆抗體，放置于4℃下過夜，滴加生物素標記的二抗，再放置于37℃溫箱孵育20 min，再滴加辣根酶標記鏈霉素的三抗，再放置于37℃溫箱孵育20 min，DAB染色。顯微鏡觀察。

1.5 結果觀察與判斷標準

AR的陽性表達主要依據是細胞核內是否出現染色為棕褐色顆粒沉積。在400倍鏡視野下隨機選擇5個不同視野進行計數，對選定視野中的腫瘤細胞總數和AR陽性腫瘤細胞數進行計數，并計算AR陽性腫瘤細胞百分比，再求5個視野的平均值作為判斷的結果，根據文獻評價標準[7]，將AR陽性腫瘤細胞百分比分為四個等級，<5%記為0分，5%～<25%記為1分，25%～≤50%記為2分，>50%記為3分。同時，計算染色強度計分，計分標準如下：無色記為0分，淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。最終評價標準以陽性腫瘤細胞百分比計分與染色強度計分相加結果為判斷依據，總分0分代表陰性表達，≥1分代表陽性表達（其中1～2分為弱陽性表達（記為1+），3～4分為中等陽性表達（記為2+），≥5分為強陽性表達（記為3+）。

P-PKB的陽性表達主要依據是細胞質內是否出現染色為棕黃色顆粒分布。在400倍視野下隨機選擇5個不同視野進行計數，對選定視野中的腫瘤細胞總數和P-PKB陽性腫瘤細胞數進行計數，并計算P-PKB陽性腫瘤細胞百分比，再求5個視野的平均值作為判斷的結果，根據文獻評價標準[8]，將P-PKB陽性腫瘤細胞百分比分為四個等級，<5%記為0分，5%～ <25%記為1分，25%～<50%記為2分，≥50%記為3分。同時，計算染色強度計分，計分標準如下：無色記為0分，淺黃色記為1分，染色強度為黃色記為2分，棕黃色記為3分。最終評價標準以陽性腫瘤細胞百分比計分與染色強度計分相加結果為判斷依據，總分0分代表陰性表達，≥1分代表陽性表達（其中1～2分為弱陽性表達（記為1+），3～4分為中等陽性表達（記為2+），≥5分為強陽性表達（記為3+）。

1.6 統計學方法

采用SPSS 19.0進行數據統計處理，，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗。對腫瘤臨床分期、淋巴結轉移情況與AR和P-PKB的相關性情況采用Spearman相關分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AR和P-PKB在乳腺癌組織中表達

三陰性乳腺癌的AR陽性表達率明顯低于非三陰性乳腺癌（P < 0.05）；三陰性乳腺癌的P-PKB陽性表達率明顯高于非三陰性乳腺癌（P < 0.05）。見表1。

2.2 三陰性乳腺癌組織中AR表達與臨床病理參數相關性

三陰性乳腺癌組織中AR的表達與臨床分期和淋巴結轉移情況呈顯著負相關（P < 0.05）。見表2。

2.3 三陰性乳腺癌組織中P-PKB表達與臨床病理參數相關性

三陰性乳腺癌組織中P-PKB的表達與臨床分期和淋巴結轉移情況呈顯著正相關（P < 0.05）。見表3。

3 討論

三陰性乳腺癌是基底細胞樣型中的一類乳腺癌，其遠處轉移率較高，患者容易出現骨轉移、內臟轉移及腦轉移[9-10]，因此，在所有類型的乳腺癌中，三陰性乳腺癌是預后性較差，腫瘤分級較高，最容易復發的一類乳腺癌[11-12]。現階段，三陰性乳腺癌缺乏有效的治療手段，靶向治療及內分泌治療幾乎無效，而放化療治療也難以取得十分滿意的效果[13-14]。為了尋找三陰性乳腺癌有效的治療手段，眾多學者開始從一些腫瘤細胞分子標志物入手研究了一些新的治療手段，如表皮生長因子受體抑制劑、抗血管生成抑制等等[15-16]，但是這些新的治療手段的有效性尚未得到大量臨床試驗數據的支持。為此，本研究想通過分析AR與P-PKB在三陰乳腺癌患者中的表達情況，來探討AR與P-PKB在三陰性乳腺癌患者病情發展中的作用機制，以期發現三陰乳腺癌治療的新靶點。

雄激素是一種性激素，AR是雄激素作用的中介物質，屬于細胞核內的X染色體上基因所編碼的核受體，根據相關研究顯示[17]，AR及其配體雄激素在乳腺癌形成與發展中扮有重要角色。本研究結果發現，54例三陰性乳腺癌患者中AR陽性表達率為48.14%，這也與相關報道一致。研究結果還顯示，三陰性乳腺癌患者的AR陽性表達率明顯低于非三陰性乳腺癌患者（P < 0.05），這說明在三陰性乳腺癌患者中AR陽性表達率較低，而在Qi等[18]的研究結果中，證實AR的陽性表達與ER和PR表達呈現正相關性，這解釋了本研究中三陰性乳腺癌患者中AR陽性表達率較低的原因。目前，ER和PR已經成為公認的判斷乳腺癌惡化程度的權威指標，而AR的陽性表達又與ER和PR有一定的關聯性，因此，AR的陽性表達也可能作為預后的重要指標。本研究結果顯示，三陰性乳腺癌組織中AR的表達與臨床分期和淋巴結轉移情況呈顯著負相關（P < 0.05），這說明AR陰性患者腫瘤組織臨床分期較高且易于發生淋巴結轉移，而AR陽性患者腫瘤組織臨床分期較低且不易發生淋巴結轉移，這也正好證明了AR的陽性表達可以作為三陰乳腺癌患者的預后的重要指標，究其原因，可能是因為AR在抑制乳腺癌細胞增殖中起到了一定的作用，阻止了乳腺原位癌向浸潤性癌的轉變。另外，干擾AR信號通路可能對治療三陰性乳腺癌患者具有一定的積極意義，因此，AR也有可能成為未來治療三陰性乳腺癌的新靶點。

PKB屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種信號轉導蛋白，P-PKB即活化的PKB，其在促進細胞異常繁殖分化、促進癌癥的發生發展中扮有重要角色，已有研究顯示[19-20]，許多腫瘤的發生與發展與P-PKB的表達密切相關，但是目前還未有關于三陰性乳腺癌患者P-PKB的表達情況的研究[21]。本文研究結果顯示，三陰性乳腺癌患者的P-PKB陽性表達率明顯高于于非三陰性乳腺癌患者（P < 0.05），說明三陰性乳腺癌具有P-PKB陽性高表達性，而P-PKB陽性高表達性又導致腫瘤組織細胞的繁殖分化，這也決定了三陰性乳腺癌預后性差、腫瘤分級高、易復發等特征。本文的研究結果也在一定程度上證實了以上推論，研究結果顯示，陰性乳腺癌組織中P-PKB的表達與臨床分期和淋巴結轉移情況呈顯著正相關（P < 0.05），說明P-PKB陽性高表達三陰性乳腺癌患者的腫瘤臨床分期較高且易于發生淋巴結轉移，而P-PKB陰性及陽性低表達三陰性乳腺癌患者的腫瘤臨床分期較低且不易發生淋巴結轉移。綜合以上分析，三陰性乳腺癌患者中P-PKB表達情況可以作為三陰性乳腺癌患者的一項重要預后指標。另外，P-PKB陽性高表達是由于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/PKB信號通路異常活化引起，PI3K/PKB信號通路的活化又與唯一的抑癌基因PTEN缺失密切相關，而以目前的醫療技術，還無法解決基因缺失引起的疾病，唯一能做到的就是降低PI3K/PKB信號通路的活化狀態，降低P-PKB的陽性表達，因此，P-PKB也有望成為治療三陰性乳腺癌的新靶點。

綜上所述，AR、P-PKB在三陰性乳腺癌的表達具有重要的意義，可以作為預后的重要指標，并有望成為未來治療三陰性乳腺癌的新靶點。

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（收稿日期：2015-12-08 本文編輯：蘇 暢）