維藥洋甘菊體外抑制宮頸癌Hela細胞增殖作用研究

蘭衛 郭玉婷 陳陽 段沐含 耿直 倪健

摘要：目的研究洋甘菊提取物對宮頸癌Hela細胞體外增值抑制的作用。方法洋甘菊提取物95%乙醇提取并純化，得到澄清的藥物溶液后，進行細胞體外給藥實驗。采用CCK-8法測定不同濃度不同時間下洋甘菊提取物作用后Hela細胞存活率。結果藥物濃度為670μg/mL時，Hela細胞抑制率為29.35%。當最高藥物濃度達到1500μg/mL時，Hela細胞抑制率為82.18%。隨著藥物濃度的增加，Hela細胞抑制率呈明顯上升趨勢。結論維藥洋甘菊提取物對宮頸癌Hela細胞的增殖有明顯的抑制作用。

關鍵詞：洋甘菊；宮頸癌；Hela細胞；細胞增殖；抑制

中圖分類號：R285.6文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2016）05-0054-02

德國洋甘菊（Matricaria chamomilia）又稱母菊，維吾爾語稱“巴木乃”，是新疆特色地產藥材[1]。根據近年來的藥理學研究表明，發現它有鎮靜、止痛及改善癌癥病人癥狀等作用[2]。

宮頸癌是一種嚴重危害婦女健康和生命的惡性腫瘤[3]。本實驗組采用人宮頸癌Hela細胞作為實驗模型，研究洋甘菊提取物體外抗宮頸癌的抑制活性，擴展洋甘菊的臨床用途。

1材料

1.1藥材洋甘菊于2015年采集自新疆和田地區策勒縣策勒鄉，經新疆醫科大學中醫學院中藥系中藥資源教研室盛萍教授鑒定為德國洋甘菊（Matricaria chamomilia）的頭狀花序。

1.2儀器酶標儀；顯微鏡，離心機，移液槍，超凈工作臺（BCM-1300A）；CO2培養箱（HERAcell 150i）。

1.3試劑0.25%胰酶（批號：140609，北京協和細胞資源中心）；胎牛血清（批號：20130511，蘭州百靈生物技術有限公司）；DMEM培養液（批號：201305，Thermo Fisher公司）；CCK-8（批號：JA611，DOJINDO laboratories）。

1.4細胞人宮頸癌Hela細胞株由中國醫學科學院藥物研究所贈予。

2方法

2.1洋甘菊提取物的提取洋甘菊干燥花序2.0kg，加10倍量95 %乙醇浸泡30 min，加熱回流2次，每次60 min，過濾，合并兩次濾液，干燥，得到洋甘菊提取物。

2.2洋甘菊提取物藥物溶液的配制洋甘菊提取物為粗提物，以DMSO助溶，用完全培養液稀釋（DMSO含量≤0.5%），配制成每mL含2 mg洋甘菊提取物的溶液，完全溶解后于離心機中離心，轉速12000 rpm，離心時間5 min，上清液經0.22 μm無菌濾膜過濾，即得用于細胞給藥的澄清藥物溶液。

2.3細胞抑制率測定采用參考文獻的方法[4]，選擇處于對數生長期的細胞，在96孔細胞培養板中每孔接種3000 個/100 μL細胞懸液，24 h后給藥，根據前期預試結果，分別設9個濃度受試組（能反映濃度與療效的量-效關系）、陽性對照組、細胞對照組和正常組，陽性對照組加入順鉑（濃度為20 μg/mL）。同時，考察細胞毒性試驗，加入上述不含藥物的DMSO溶液，作為細胞對照組；加入正常培養基，作為正常組。再培養72 h，然后在細胞培養板中每孔加入100 μL CCK-8，在37℃環境中孵育4 h，然后測定其450 nm吸光度，獲取受試藥物對腫瘤細胞抑制率和IC50[5]。

2.4Hela細胞形態學觀察根據上述細胞增殖抑制實驗，取12孔板，加入濃度為890、670 μg/mL的藥物，觀察藥物對細胞形態的影響。參照相關文獻[6]，取對數生長期的Hela細胞接種于12孔細胞培養板內，每孔接種50000個/2 mL，培養24 h，實驗組分別加入加入濃度為890、670 μg/mL的洋甘菊提取物，對照組加入空白培養液，培養72 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化。

3結果

3.1洋甘菊提取物對Hela細胞的增殖抑制作用采用CCK-8法測定分別加入1500、1200、1000、890、670、460、330、180、95 μg/mL不同濃度藥物溶液作用72 h后Hela細胞的存活率，見圖1。與對照組未經處理的Hela細胞相比，藥物濃度為為890 μg/mL時，Hela細胞抑制率為51.16%。當最高藥物濃度達到1500 μg/mL時，Hela細胞抑制率為82.18%。相同作用時間增加給藥濃度，細胞抑制率明顯上升。結果表明，洋甘菊提取物對Hela細胞的增殖有顯著抑制作用。其中，IC50為890 μg/mL，對Hela細胞抑制率為51.16%。同時，將DMSO以完全培養液稀釋后，DMSO的含量同給藥組，經實驗觀察，DMSO對照組各濃度對細胞無明顯抑制作用，并與正常組接近。

3.2Hela細胞形態學觀察參照相關文獻[6]，觀察細胞的形態變化，見圖2。

4討論

本研究采用CCK-8法測定細胞存活率，結果表明，洋甘菊提取物可明顯抑制人宮頸癌Hela細胞的增殖。本實驗對Hela細胞的活性進行檢測，結果顯示，Hela細胞的存活率隨洋甘菊提取物給藥濃度的增加而減小；綜上所述，洋甘菊提取物能夠抑制人宮頸癌Hela細胞的增殖。

洋甘菊中含多種活性成分，最為重要成分的是黃酮類成分及其苷類成分，主要有芹菜素、木犀草素和槲皮素、木犀草苷等[7-8]，蘭衛等[9-10]測定了芹苷元-7-葡萄糖苷和總皂苷的含量。

胡繼松等[11]研究了芹菜中五種成分對肝癌細胞株HepG2、白血病細胞株HL-60的抑制效果。結果表明，芹菜素（98%）和芹菜醇提物（黃酮含量40%）樣品對HepG2和HL-60有一定的抑制作用，而試驗中芹菜粗黃酮（黃酮含量70%）、芹菜苷（98%）、3-甲氧基芹菜苷（98%）對HepG2和HL-60這兩種腫瘤細胞均無明顯抑制效果。

天然藥物通過多種途徑對腫瘤進行預防和治療，抗氧化作用是途徑之一[12]。韓松林等報道了洋甘菊具有抗氧化作用[13]。夏娜等報道了洋甘菊中多糖與黃酮粗提物抗氧化及抑制亞硝化作用[14]。由于洋甘菊多成分，多靶點的特點，其提取物抗腫瘤作用機制廣泛，洋甘菊抑制宮頸癌Hela細胞增殖作用的物質基礎和可能的作用機制還有待進一步研究，其抑制宮頸癌Hela細胞增殖作用的“藥—效”對應關系有待進一步明確。

參考文獻：

[1]新疆衛生廳.維吾爾藥標準（上冊）[S].烏魯木齊：新疆科技衛生出版社，1993：255.

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[3]陳麗春，毛建衛，龔金炎.洋甘菊中芹菜苷提取工藝研究[J].天然產物研究與開發，2013，25：986-989.

[4]許麗萍.CCK-8法檢測AT#9對腫瘤細胞的生長抑制作用[J].北方藥學，2012，9（1）：43-44.

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[6]何楊，段斐，靳棉，等.山茱萸水提取物對Hela細胞體外增殖的影響[J].山東醫藥，2011，51（40）：83-84.

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[8]周伯庭，李新中.母菊的化學成分研究[J].湖南中醫學院學報，2001，21：27-28.

[9]蘭衛，郭玉婷，耿 直，等.洋甘菊中芹苷元-7-葡萄糖苷含量測定[J].新疆醫科大學學報，2014，37（3）：303-305.

[10]蘭衛，郭玉婷，耿 直，等.德國洋甘菊花序中總皂苷的含量測定[J].新疆醫科大學學報，2014，37（3）：315-316.

[11]胡繼松，陳靜萍，陳亮，等.芹菜黃酮類物質降壓降脂及抗腫瘤藥理活性篩選[J].湖南農業科學，2014，（11）：9-12.

[12]張柯，馬勝林.天然藥物抗腫瘤機制的研究進展[J].中華中醫藥雜志，2011，26（10）：342-344.

[13]韓松林，李新霞，勉強輝，等.薄層生物自顯影技術比較新疆2種洋甘菊抗氧化活性[J].中國中藥雜志，2013，38（2）：193-198.

[14]夏娜，陶海燕，趙麗鳳.洋甘菊中多糖與黃酮粗提物抗氧化及抑制亞硝化作用研究[J].食品工業，2014，35（11）：293-295.