牛骨酶解物對制備牛肉香精中揮發性風味成分的影響

成曉瑜+李迎楠+劉文營+賈曉云

摘 要：以牛肉香精為研究對象，從揮發性風味物質組成和電子鼻分析角度研究不同牛骨酶解物添加量對其風味品質的影響。結果表明：不同牛骨酶解物添加量使牛肉香精在風味物質方面有較大的差異性。牛骨酶解物添加量為6 g時，牛肉香精中揮發性物質含量較高，達到95.39%，其中具有特征風味的吡嗪類、醛類、酮類化合物的含量相對較高；運用電子鼻技術分析發現，除添加量為8 g和10 g時有部分重疊，其余條件下樣品存在顯著性差異。在此條件下得到的牛肉香精烤香味較為明顯，具有良好的風味香氣。

關鍵詞：牛肉香精；風味物質；牛骨酶解物；電子鼻；固相微萃取-氣相色譜-質譜

Effect of Addition of Enzymatic Hydrolysate of Bovine Bone into Maillard Reaction System on Volatile Aroma Composition of Beef Essence

CHENG Xiaoyu， LI Yingnan， liu Wenying， JIA Xiaoyun

（China Meat Processing and Engineering Center， China Meat Research Center， Beijing Academy of Food Sciences，

Beijing 100068， China）

Abstract： This study was intended to examine the effect of adding different amounts of bovine bone collagen hydrolysate prepared with flavourzyme to the Maillard reaction system used to produce beef essence on the flavor quality of reaction products. The results showed that the volatile flavor compounds of beef essence varied significantly depending on the amount of added bovine bone collagen hydrolysate. The addition of 6 g of bovine bone collagen hydrolysate led to the generation of high amounts of volatile compounds （95.39%） in the beef essence， with the characteristic flavor compounds pyrazines， aldehydes and ketones being dominant. Electronic nose analysis suggested that the flavor compounds formed in the presence of 8 and 10 g of the hydrolysate were partly identical， and significant differences were found at other addition levels of the hydrolysate. The beef essence obtained under this condition had an outstanding roast aroma and good flavor.

Key words： beef essence； flavor substances； bovine bone collagen hydrolysates； electronic nose； solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry （SPME-GC-MS）

中圖分類號：TS251.94 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2016）04-0001-05

DOI： 10.15922/j.cnki.rlyj.2016.04.001

引文格式：

成曉瑜， 李迎楠， 劉文營， 等. 牛骨酶解物對制備牛肉香精中揮發性風味成分的影響[J]. 肉類研究， 2016， 30（4）： 1-5. DOI： 10.15922/j.cnki.rlyj.2016.04.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

CHENG Xiaoyu， LI Yingnan， liu Wenying， et al. Effect of addition of enzymatic hydrolysate of bovine bone into maillard reaction system on volatile aroma composition of beef essence[J]. Meat Research， 2016， 30（4）： 1-5. （in Chinese with English abstract） DOI： 10.15922/j.cnki.rlyj.2016.04.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

還原糖的羰基和游離氨基間的美拉德反應與食品風味之間的關系，為美拉德反應制備肉味香精奠定了基礎[1]。美拉德反應獲得的肉類風味物質能夠比較逼真地讓人感受到肉香氣的濃郁和口味的厚重，吸引了大量的學者研究，也成為咸式香精市場的寵兒[2]。

氨基作為美拉德反應的重要前提物質，它的來源對反應十分重要。近年來研究發現不同來源蛋白質、多肽或氨基酸提供的氨基對反應產物風味物質的形成影響很大。Eric等[3]研究發現向葵粕多肽美拉德反應產物可作為增香劑；Ogasawara等[4]研究發現1 000～5 000 D的多肽是增強反應產物風味、鮮味及持續性的關鍵；Liu等[5]研究發現不同種類的蛋白質或多肽通過美拉德反應可增強加工過程中的風味；Huang[6]、綦艷梅[2]等對大豆、牛肉等水解產物、半胱氨酸對反應物揮發性風味物質的影響進行了分析。而屠宰副產物牛骨的蛋白質十分豐富，其酶解液含有不同分子質量的多肽以及氨基酸[7]，可作為美拉德反應制備牛肉香精的重要氨基來源。

目前，國內外研究多集中于以肉蛋白為來源的酶解產物對反應物風味的影響[8-9]，以牛骨酶解產物的相關研究較少。因此，增加牛骨在肉味香精方面的開發，對副產物的綜合利用具有更深遠的意義。實驗中采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、電子鼻風味分析方法，研究不同牛骨酶解物添加量對牛肉香精主要揮發性成分的影響，為牛骨在牛肉香精的開發應用提供理論技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉、牛骨購于北京豐臺牛街清真市場。

復合動物蛋白酶、風味蛋白酶 諾維信（中國）投資有限公司；木糖、半胱氨酸、丙氨酸等均為食品級。

1.2 儀器與設備

SUPELCO固相微萃取 美國Sigma公司；TRACE 1310氣相色譜-TSQ8000質譜聯用儀 美國Thermo公司；PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國Airsense公司；LGJ-30D冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉酶解物、牛骨酶解物制備

參考文獻[7]方法，取牛骨破碎后加熱至110 ℃，取下層骨渣酶解，酶解溫度為60 ℃，復合動物蛋白酶15 mg/g，酶解4 h，風味蛋白酶10 mg/g，酶解2 h后終止反應；將酶解液凍干后備用。

稱取新鮮牛肉，按肉水比1∶1（m/m）加入水，經組織搗碎機攪碎，加入0.4%風味蛋白酶，50 ℃酶解4 h后終止反應，冷卻至室溫備用。

1.3.2 美拉德反應制備牛肉香精

準確稱量并添加牛肉酶解物50 g、木糖5 g、葡萄糖2 g、酵母1 g、半胱氨酸5 g、牛油5 g、水解植物蛋白液（hydrolyzed vegetable protein，HVP）30 g、丙氨酸1.5 g、甘氨酸3 g，分別添加牛骨酶解物2、4、6、8、10 g，混合均勻，美拉德反應時間為75 min，反應溫度為105 ℃，考察不同牛骨酶解物添加量對牛肉香精風味的影響。

1.3.3 GC-MS測定

固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）：取1 mL牛肉香精樣品裝入頂空瓶中，50 ℃水浴鍋中平衡30 min，將事先250 ℃條件下老化30 min的固相微萃取針頭插入頂空瓶中，吸附30 min。吸附結束后，將萃取針頭插入氣相色譜進樣口，在250 ℃條件下解析5 min，進行GC-MS測定[10-11]。

色譜條件：色譜柱DB-Wax極性柱；流速1.0 mL/min。程序升溫：進樣口溫度250 ℃，起始柱溫35 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫到200 ℃，再以10 ℃/min升到250 ℃保持5 min。質譜條件：傳輸線溫度260 ℃；離子源溫度280 ℃；質譜質量掃描范圍設定為40～600 u。

1.3.4 電子鼻傳感器檢測

PEN3型電子鼻傳感器的不同金屬氧化物半導體型化學傳感元件對應的敏感物質類型不同[12]。不同來源的氨基得到的美拉德反應產物不同，進而影響揮發性風味物質的種類和含量，因此在傳感器上呈現不同的氣味感應信號。

準確量取1 mL牛肉香精，25 ℃恒溫環境平衡2 h，運用電子鼻傳感器對不同樣品進行檢測，傳感型號在60 s后基本穩定，選定信號采集時間為70 s。

1.4 數據處理

風味組分的質譜分析：檢索NIST11.L和Demo.l數據庫，對不同條件下牛肉香精的揮發性組分進行定性分析，并根據面積歸一化法求得各成分的相對百分含量。

電子鼻分析數據分析：運用Winmuster軟件對數據進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）。

2 結果與分析

2.1 SPME-GC-MS測定分析結果

在牛肉香精的熱反應體系中，添加不同牛骨酶解物2、4、6、8、10 g分別得到牛肉味的反應物，采用SPME方法，結合GC-MS，對揮發性風味成分進行分析，得到的總離子流圖如圖1所示，鑒定出的揮發性風味成分見表2。

由表2可知，在牛骨酶解物添加量2、4、6、8、10 g時制備的牛肉香精經GC-MS分別檢出37、36、43、43、42 種揮發性風味成分，主要是醇類、醛類、酮類、酯類、含氮類、酸類等，其種類及相對含量見表3。主要包括：糠醇、2-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛、3-甲基-2-丁酮、

2-甲基四氫呋喃-3-酮、3-甲基-1，2-環戊二酮、乙酸異丙烯酯、γ-戊內脂、2-乙基-6-甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、

2-乙酰基吡咯、愈創木酚等，這些化合物揮發性成分含量較高，不同牛骨酶解物添加量制備的產物揮發性風味物質的總量由高到低依次為6 g>8 g>10 g>4 g>2 g。

醇類化合物是由羰基化合物還原或脂肪經氧化分解產生的。在反應體系中醇類較其他類別相對含量最高，主要為糠醇，糠醇具有焦糖香、甜香及咖啡香等氣味[7]，4 種反應物含量均在25%以上，10 g的牛骨酶解物添加量的相對含量最高，高達36.96%。Wettsinghe等[13]研究發現不飽和醇閾值較低，具有蘑菇香味，對肉品風味的形成具有一定的作用。

含氮類的化合物總量列居第2位，種類也最多。含氮類化合物是肉品最重要的香味呈味物[14]，其中吡嗪類化合物是揮發性風味成分中的重要組分，在反應體系中含量最高。吡嗪是美拉德反應所產生的主要揮發性物質之一，這些芳香成分已被確認為燒烤香的直接貢獻化合物[1]。不同牛骨酶解物添加量的反應產物中均含有2-乙基-6-甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2-甲基-6-乙烯基吡嗪、2-乙酰基吡咯、2，5-二甲基-3-丙基吡嗪，它們提供燒烤牛肉的風味。相對含量較高的2，3，5-三甲基吡嗪具有堅果香、

可可及土豆樣香氣；2-乙酰基吡咯具有蔬菜、蘑菇及土豆香氣[7]。牛骨酶解物添加量為6 g時，牛肉香精中含氮類化合物含量相對較高，達到18.24%，其中吡嗪類化合物含量為14.04%；而添加量為4 g和8 g時吡嗪類化合物含量較低，添加量為2 g時吡嗪類化合物種類雖較高，但整體風味物質含量較少，且香味不夠濃郁。因此牛骨酶解物添加量為6 g時牛肉香精烤香味較為明顯，具有良好的風味香氣。

醛、酮類化合物屬于羰基類化合物，在檢測出的揮發性風味化合物中，羰基類化合物對牛肉香精特征風味的形成具有重要作用，不同肉香風味的差異主要來自于羰基化合物的定性定量差異[15]。醛、酮類化合物可以增強牛肉香精的層次感，使其風味更加圓潤[16]。牛骨酶解物添加量的不同，對牛肉香精中醛、酮類化合物含量影響較大，其中添加量為6 g時，牛肉香精中羰基類化合物含量較高，達到29.48%，且種類較多，其次為添加量為8 g時含量為26.99%，而添加量為2 g時羰基化合物含量最低。醛類化合物的閾值較低[17]，能夠賦予牛肉香精清香、果香及堅果香，其中含量相對較高的2-甲基丁醛具有果香及堅果香，苯甲醛可能賦予產物脂香風味。而酮類化合物多具有甜香味，其中3-羥基-2-丁酮具有甜香，2-甲基四氫呋喃-3-酮具有果香及青香，5-甲基-2-乙酰基呋喃具有烤香、煙熏香及清甜的氣味[18]。

酸類化合物可能是由相應的醇、醛在美拉德反應過程中高溫氧化得到的。牛骨酶解物添加量為4、10 g時含量較高，其中含量相對較高的乙酸呈現刺激、尖酸的氣息，對牛肉香精的風味有一定的影響，其余條件下酸類化合物含量相差不大。酯類化合物主要是游離的脂肪酸和脂肪氧化產生的醇酯化產生的，內酯和硫酯對肉味香精有一定的貢獻。其中添加量為6 g時，牛肉香精中酯類化合物含量較高，達到5.39%，且種類達8 種，其中相對含量較高的乙酸酯類具有愉快的水果香氣；而γ-戊內酯具有果香及甜香。酯類化合物在揮發性風味物質中所占比例相對較少。醚類、酚類化合物檢測出的相對較少，二糠基醚具有咖啡、榛子、堅果香氣，而愈創木酚具有可口的肉香及煙熏味[18]。

綜合上述分析得到，牛骨酶解物添加量為6 g時，牛肉香精中揮發性物質含量較高，其中具有特征風味的吡嗪類化合物及醛、酮類化合物的含量相對較高。可認為，在該反應條件下牛肉香精中牛骨酶解物添加量為6 g較為適宜。

2.2 電子鼻測定結果

利用電子鼻技術從整體香氣成分水平上對不同牛骨酶解物添加量條件下牛肉香精進行主成分分析和線性判別分析。PCA轉換中得到的貢獻率越大，則主要成分可以更好地反映多指標信息[19-20]。由圖2A可知，PC1、PC2的方差貢獻率分別為88.22%和9.10%，總貢獻率為97.32%，說明其主成分可以很好地反映指標信息，除添加量為8 g和10 g條件下有部分重疊，其余數據點均分布在各自的區域內，說明不同牛骨酶解物添加量下肉味香精的主成分之間有顯著性差異，添加量為4 g時，數據點與其他距離較大，說明添加量為4 g與其他條件主成分有明顯差異。由圖2B可知，LD1、LD2的方差貢獻率分別為78.77%和8.67%，總貢獻率為87.44%，其中添加量為8 g和10 g時有部分重疊，說明二者之間具有一定的相似性，其余數據分布較為分散。因此，采用PCA和LDA分析方法，能夠區分出這5 種添加量下樣品間存在顯著性差異，風味均有所改變。

圖 2 不同牛骨酶解物添加量肉味香精的PCA分析（A）和LDA分析（B）

Fig.2 PCA analysis （A） and LDA analysis （B） of beef essences produced with different amounts of bovine bone collagen hydrolysate

3 結 論

不同添加量牛骨酶解物的牛肉香精在揮發性風味物質方面有較大的差異性，可見牛骨酶解物含量對牛肉香精的風味品質有很大的影響。通過SPME-GC-MS對揮發性組分進行定性、定量分析結果顯示，牛骨酶解物添加量為6 g時，牛肉香精中揮發性物質含量較高，達到95.39%，其中具有特征風味的吡嗪類化合物及醛、酮類化合物的含量相對較高；運用電子鼻技術分析發現，除添加量為8 g和10 g時有部分重疊，其余條件下樣品存在顯著性差異。在此條件下得到的牛肉香精烤香味較為明顯，具有良好的風味香氣。

本研究同時添加牛肉酶解物及牛骨酶解物發生美拉德反應，同時對產物風味品質進行分析，判斷出較為適宜的牛骨酶解物添加量，同時得到風味較好的牛肉香精，為牛肉香精的研發提供一定的理論參考。

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