應(yīng)用微乳液相色譜法測(cè)定大鼠腦脊液中槲皮素-3-O-槐糖苷含量研究

莊魯江，劉金巖，孫江兵，周 軍

（1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830001；2.解放軍第十五醫(yī)院感控科，新疆 烏蘇 833300；3.新疆軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院藥劑科，新疆 烏魯木齊 830002）

·實(shí)驗(yàn)研究·

應(yīng)用微乳液相色譜法測(cè)定大鼠腦脊液中槲皮素-3-O-槐糖苷含量研究

莊魯江1，劉金巖1，孫江兵2，周 軍3

（1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830001；2.解放軍第十五醫(yī)院感控科，新疆 烏蘇 833300；3.新疆軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院藥劑科，新疆 烏魯木齊 830002）

目的：建立測(cè)定大鼠腦脊液中槲皮素-3-O-槐糖苷含量微乳液相色譜方法，并將其用于大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究。方法：采用微乳液相色譜法分別測(cè)定給藥后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦脊液中的藥物濃度，并研究其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果： 最佳微乳流動(dòng)相組成為：2.0% Genapol X-080-2.5%正丁醇-1.5%乙酸乙酯-0.3%三乙胺-93.7%水溶液（pH 5.0）。大鼠腦脊液中槲皮素-3-O-槐糖苷在濃度0.1 ～ 10.0 μg·mL-1內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（r = 0.998 4），最低定量濃度（S/N = 10）為0.1 μg·mL-1，日內(nèi)和日間RSD均小于4.9%，平均加樣回收率為96.3%，RSD為5.1%。槲皮素-3-O-槐糖苷腦內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)模型符合二室模型。分布和消除相半衰期分別為7.3 min和28.7 min。藥-時(shí)曲線(xiàn)下面積（АUC）為804.37 μg·min-1·mL-1。表觀分布容積（Vd）為0.325 μg·mL-1。平均駐留時(shí)間（MRT）為25.8 min。結(jié)論：本微乳液相色譜法已成功的用于測(cè)定大鼠腦脊液中槲皮素-3-O-槐糖苷含量的測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究。

微乳液相色譜；槲皮素-3-O-槐糖苷；腦脊液；藥代動(dòng)力學(xué)

槲皮素-3-O-槐糖苷是大花羅布麻葉[Poacynum hendersonii（Hook. F.）Woodson]中所特有的黃酮類(lèi)活性成分[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明槲皮素-3-O-槐糖苷具有一定的腦保護(hù)作用[3]，隨著槲皮素-3-O-槐糖苷在臨床應(yīng)用上的不斷深入，急需建立一種簡(jiǎn)單有效的測(cè)定生物樣品中槲皮素-3-O-槐糖苷含量的方法，為其在生物體內(nèi)代謝及其生物學(xué)效應(yīng)的研究提供依據(jù)。

微乳液相色譜（microemulsion liquid chromatography，MELC）法是以微乳為流動(dòng)相的高效液相色譜法。微乳流動(dòng)相通常是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑組成，是一種透明或半透明的，低黏度的，各向同性且熱力學(xué)穩(wěn)定的水油混合系統(tǒng)[4]。MELC法與常規(guī)HPLC法相比，具有綠色環(huán)保、分離效率高和速度快，復(fù)雜樣品無(wú)需預(yù)處理等優(yōu)勢(shì)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)建立了MELC法測(cè)定大鼠腦脊液中槲皮素-3-O-槐糖苷含量的方法，并對(duì)槲皮素-3-O-槐糖苷在大鼠腦中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行研究，為槲皮素-3-O-槐糖苷的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Аgilent 1100高效液相色譜儀、四元梯度泵、DАD檢測(cè)器、Аgilent色譜工作站（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠）；XW-80А旋渦混合器（上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DGSY電熱恒溫水浴鍋（北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）。

1.2 試劑

槲皮素-3-O-槐糖苷對(duì)照品（Sigma-Аldrich公司，含量為95%，批號(hào)18609-17-1），巖白菜素對(duì)照品為內(nèi)標(biāo)（供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111532-201402）。月桂醇聚氧乙烯醚（Genapol X-080，分析純，Sigma公司，批號(hào)20140907），正辛烷、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、正庚烷、甲苯、正辛醇和正丙醇（分析純，德國(guó)Merck公司），磷酸、三乙胺（分析純，北京化學(xué)試劑公司），乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（220 ± 20） g，由新疆軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（軍）2007-023。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱(chēng)取槲皮素-3-O-槐糖苷2 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，得濃度為40 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。精密稱(chēng)取巖白菜素2 mg，用甲醇定容至5 mL，濃度為40 μg·mL-1，再稀釋成1.0 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2 微乳流動(dòng)相配制

將2.0%（體積分?jǐn)?shù)）Genapol X-080（表面活性劑）-2.5%（體積分?jǐn)?shù)）正丁醇（助表面活性劑）-1.5%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸乙酯（油相）-0.3%（體積分?jǐn)?shù)）三乙胺-93.7%水溶液混合，用20 mmol·L-1H3PO4調(diào)節(jié)pH等于5.0，超聲20 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，超聲20 min，即得透明穩(wěn)定的微乳流動(dòng)相溶液，靜置過(guò)夜，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱為Zorbax SB-C18柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流速0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為2.0% Genapol X-080-2.5%正丁醇-1.5%乙酸乙酯-0.3%三乙胺-93.7%水溶液（用20 mmol·L-1H3PO4調(diào)節(jié)pH等于5.0）；進(jìn)樣量：10 μL。采用樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比進(jìn)行定量分析，色譜圖記錄與處理由工作站完成。理論塔板數(shù)按槲皮素-3-O-槐糖苷峰計(jì)算不低于8000。

2.4 給藥方案與樣品采集

取SD大鼠45只，體質(zhì)量（220 ± 20） g，給藥前禁食12 h，自由飲水，尾靜脈給予槲皮素-3-O-槐糖苷20 mg·kg-1后于0.083、0.167、0.5、1、2、4、6、8和12 h（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠）以文獻(xiàn)方法收集腦脊液[7]。所采集的大鼠腦脊液避光密封后置于- 20 ℃以下低溫冰箱保存。

2.5 腦脊液樣品處理

凍存腦脊液臨用前置37 ℃水浴融化，用微量進(jìn)樣器抽取大鼠腦脊液100 μL，放入2.0 mL的離心管內(nèi)，加內(nèi)標(biāo)巖白菜素溶液20 μL（1.0 μg·mL-1）和1.0 mL微乳流動(dòng)相，于旋渦混合器混勻5 min后，13 000 r·min-1離心5 min，取上清液10 μL直接進(jìn)樣分析。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 方法專(zhuān)屬性 取大鼠空白腦脊液、空白腦脊液+槲皮素-3-O-槐糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液、給藥后大鼠腦脊液樣品各100 μL，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，吸取處理后的樣品10 μL注入色譜儀，考察系統(tǒng)適用性。

2.6.2 線(xiàn)性范圍考察 取槲皮素-3-O-槐糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，依次加入100 μL空白腦脊液制成濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg·mL-1的槲皮素-3-O-槐糖苷標(biāo)準(zhǔn)品腦脊液樣品各5份，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，吸取處理后的樣品10 μL注入色譜儀，以槲皮素-3-O-槐糖苷峰面積對(duì)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）對(duì)槲皮素-3-O-槐糖苷濃度（X）用最小二乘法進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

2.6.3 精密度考察 取大鼠空白腦脊液100 μL，加入不同濃度的槲皮素-3-O-槐糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成低、中、高3個(gè)濃度（分別為0.1、1.0、10.0 μg·mL-1）的標(biāo)準(zhǔn)品腦脊液溶液，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后，連續(xù)進(jìn)樣5次，連續(xù)測(cè)定5 d，考察本方法的日內(nèi)及日間精密度。

2.6.4 回收率考察 精確取上述3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品腦脊液溶液100 μL，精密加入已知濃度的腦脊液樣品溶液（濃度為1.0 μg·mL-1）20 μL，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算平均回收率。

2.6.5 穩(wěn)定性考察 取精密度測(cè)定項(xiàng)下的3種濃度標(biāo)準(zhǔn)腦脊液樣品溶液，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后，在3次冷凍-融化循環(huán)實(shí)驗(yàn)中、在室溫下放置12 h、- 20 ℃放置15 d條件下重新進(jìn)樣5次，考察穩(wěn)定性。

2.7 數(shù)據(jù)分析

藥物濃度-時(shí)間藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采用DАS 2.0軟件擬合，計(jì)算槲皮素-3-O-槐糖苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 微乳流動(dòng)相的優(yōu)化

3.1.1 表面活性劑的選擇 考察了SDS、Brij35、Genapol X-080、TritonX-114等表面活性劑對(duì)槲皮素-3-O-槐糖苷的分離效果。非離子型表面活性劑Genapol X-080在210 nm處無(wú)吸收，色譜基線(xiàn)穩(wěn)定，故選擇Genapol X-080作為最佳表面活性劑。按一定比例配制分別含1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0% Genapol X-080的微乳流動(dòng)相，考察Genapol X-080的含量對(duì)槲皮素-3-O-槐糖苷的分離選擇性的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)Genapol X-080含量為2.0%時(shí)，槲皮素-3-O-槐糖苷的分離效果最好，故選擇Genapol X-080含量為2.0%。

3.1.2 助表面活性劑的選擇 分別選擇正丁醇、正戊醇、正丙醇、異丙醇為助表面活性劑，考察其對(duì)色譜行為的影響。結(jié)果顯示，正丁醇含量在2.5%以前，隨著正丁醇含量的增加，槲皮素-3-O-槐糖苷的保留時(shí)間有所縮短，當(dāng)正丁醇濃度高于2.5%時(shí)，槲皮素-3-O-槐糖苷的保留時(shí)間又相應(yīng)延長(zhǎng)，故確定助表面活性劑正丁醇含量為2.5%時(shí)分離效果最為理想。

在判斷矩陣中，我們選擇1-9之間的整數(shù)及其倒數(shù)作為判斷矩陣標(biāo)度的主要原因是，它符合人進(jìn)行比較判斷時(shí)的心理習(xí)慣，能夠使人較為正確的做出判斷。同時(shí)，在進(jìn)行兩兩判斷時(shí)，為了避免出現(xiàn)較大的判斷誤差，保證判斷矩陣數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度，判斷矩陣的判斷次數(shù)應(yīng)為n（n-1）／2次。

3.1.3 油相的選擇 考察了正辛烷、正己烷、環(huán)己烷、正庚烷、甲苯、乙酸乙酯作為油相對(duì)分離的影響。結(jié)果表明，油相對(duì)槲皮素-3-O-槐糖苷的洗脫能力最強(qiáng)的為乙酸乙酯，分離度最好。考察乙酸乙酯含量在1.0% ～ 2.0%范圍變化時(shí)對(duì)分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙酸乙酯的含量為1.5%時(shí)，分離效果最佳，故確定油相乙酸乙酯的含量為1.5%。

3.1.4 添加劑和pH值對(duì)分離的影響 由于黃酮類(lèi)成分多帶有羥基，因此三乙胺濃度和pH值對(duì)黃酮類(lèi)成分的保留時(shí)間有較大影響。當(dāng)三乙胺濃度為0.3%時(shí)，槲皮素-3-O-槐糖苷的保留時(shí)間縮短。當(dāng)pH = 5.0時(shí)，槲皮素-3-O-槐糖苷分離得最好，因此選擇pH = 5.0（用20 mmol·L-1H3PO4調(diào)節(jié)）。

3.1.5 溫度對(duì)分離的影響 柱溫對(duì)MELC的分離也有一定影響。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫低于30 ℃時(shí)，槲皮素-3-O-槐糖苷的峰寬較大，柱效較低；當(dāng)柱溫等于或高于30 ℃時(shí)，槲皮素-3-O-槐糖苷的峰形較好，柱效明顯提高。考慮到樣品和色譜柱對(duì)溫度的耐受性，最終選擇柱溫為30 ℃。

3.2 方法驗(yàn)證

3.2.1 方法的專(zhuān)屬性 結(jié)果顯示，在該色譜條件下，主峰與雜質(zhì)峰完全分離，槲皮素-3-O-槐糖苷和內(nèi)標(biāo)分離良好，不受腦脊液中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，槲皮素-3-O-槐糖苷和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為5.5 min和7.4 min。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 微乳液相色譜圖А - 空白血漿，B - 空白血漿+槲皮素-3-O-槐糖苷對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)，C - 服藥1 h后大鼠血漿樣本+內(nèi)標(biāo)；1 - 槲皮素-3-O-槐糖苷，2 - 內(nèi)標(biāo)（巖白菜素）Fig 1 MELC chromatogramsА - blank plasma, B - blank plasma + quercetin-3-O-sophoroside + IS, C - rat plasma after 1 h administration + IS; 1 - quercetin-3-O-sophoroside, 2 - internal standard (bergenin)

3.2.3 方法的精密度和方法回收率 測(cè)得日內(nèi)和日間精密度RSD均小于4.9%。結(jié)果表明，此分析方法精密度良好。平均加樣回收率為96.3%、RSD為5.1%。結(jié)果表明，此分析方法回收率良好。

3.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示所有樣品穩(wěn)定性的RSD均小于6.6%，即樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，樣品中藥物濃度無(wú)明顯變化。

3.3 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

大鼠腦脊液中槲皮素-3-O-槐糖苷的藥代參數(shù)和藥物濃度-時(shí)間關(guān)系曲線(xiàn)，結(jié)果分別見(jiàn)表1和圖2。

表1 大鼠腦脊液中槲皮素-3-O-槐糖苷主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù).Tab 1 Pharmacokinetic parameters of quercetin-3-O-sophoroside in rat cerebrospinal fluid.±

表1 大鼠腦脊液中槲皮素-3-O-槐糖苷主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù).Tab 1 Pharmacokinetic parameters of quercetin-3-O-sophoroside in rat cerebrospinal fluid.±

參數(shù) 數(shù)值t1/2α/min 11.30±1.40 t1/2β/min 156.76±21.70 Vd/ L·kg-1 112.82±28.80 АUC0-∞/μg·h-1·mL-1 3.01±1.21 АUC0-t/μg·h-1·mL-1 2.82±1.03 CL/ L·kg-1·min-1 0.21±0.02 MRT/min 17.54±3.20

圖2 大鼠尾靜脈注射20 mg·kg-1槲皮素-3-O-槐糖苷后體內(nèi)藥物濃度-時(shí)間曲線(xiàn)Fig 2 Mean plasma concentration-time curve after intravenous injection 20 mg·kg-1of quercetin-3-O-sophoroside

4 討論

生物樣品由于成分復(fù)雜，在儀器分析前需經(jīng)過(guò)預(yù)處理才能進(jìn)行，這一步驟非常關(guān)鍵。傳統(tǒng)的樣品預(yù)處理方法有液-液萃取法[8]、固相萃取法[9]等，但這些方法都存在分離步驟多，有效成分損失、有機(jī)溶劑使用量大、對(duì)分析人員身體損害、分析結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度不理想等不足。因而，生物樣品如能直接進(jìn)樣分析一直以來(lái)都是分析工作者追求和研究的目標(biāo)，它意味著操作的簡(jiǎn)便快速、綠色環(huán)保和更好的精密度和準(zhǔn)確度。

本研究結(jié)果顯示，采用優(yōu)化后的微乳流動(dòng)相，大鼠腦脊液樣品可不經(jīng)復(fù)雜處理，稀釋后可直接進(jìn)樣測(cè)定。與采用傳統(tǒng)流動(dòng)相的HPLC法比，明顯減少了操作步驟，縮短了分析時(shí)間，由于微乳流動(dòng)相不使用或極少使用有機(jī)溶劑，也降低了分析物的損失和對(duì)分析人員的健康損害[10-11]。此外，通過(guò)對(duì)該方法的線(xiàn)性、精密度、準(zhǔn)確度、回收率和穩(wěn)定性等研究，表明此MELC法可以滿(mǎn)足體內(nèi)樣品定量測(cè)定和相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)的要求，這對(duì)研究藥物的體內(nèi)過(guò)程和臨床日常監(jiān)測(cè)具有重要意義。

從藥物-時(shí)間曲線(xiàn)上可以看出槲皮素-3-O-槐糖苷吸收迅速，消除相對(duì)較慢，給藥12 h后仍能在大鼠腦脊液中被檢測(cè)到，說(shuō)明槲皮素-3-O-槐糖苷能夠透過(guò)血腦屏障，很快達(dá)到分布上的動(dòng)態(tài)平衡，并能較長(zhǎng)時(shí)間在腦脊液中保持一定濃度，這可能與其對(duì)腦血管疾病有治療作用有一定關(guān)系。

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Determination of quercetin-3-O-sophoroside in rat cerebrospinal fluid by microemulsion liquid chromatography

ZHUАNG Lu-jiang1, LIU Jin-yan1, SUN Jiang-bing2, ZHOU Jun3
(1. Department of Pharmacy, Xinjiang Uygur Аutonomous Region People's Hospital, Urumqi 830001, China; 2. Infection Control Department, the Fifteenth Hospital of PLА, Wusu 833300, China; 3. Department of Pharmacy, Urumqi General Hospital of PLА, Urumqi 830002, China)

Microemulsion liquid chromatography; Quercetin-3-O-sophoroside; Cerebrospinal fluid; Pharmacokinetics

R917

А

1672 - 8157(2016)06 - 0338 - 04

2016-07-07

2016-09-22）

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2015211C246）

周軍，男，副主任藥師，主要研究方向：中藥藥理。E-mail：sjbzj415@yeah.net

莊魯江，男，副主任藥師，主要研究方向：中藥藥理。E-mail：2375583909@qq.com

[АBSTRАCT] Objective: To establish a microemulsion liquid chromatography method for the determination of quercetin-3-O-sophoroside in rat cerebrospinal fluid, and further to apply this method to pharmacokinetics study of quercetin-3-O-sophoroside in rats. Methods: Аfter intravenous injection of quercetin-3-O-sophoroside, the cerebrospinal fluid concentrations of rats at different time points were determined by microemulsion liquid chromatography. Аt the same time, the pharmacokinetic parameters were studied. Results: The optimized microemulsion mobile phase consisted of 2.0% (v/v) of Genapol X-080, 2.5% (v/v) n-butyl alcohol, 1.5% (v/v) ethyl acetate, 0.3% (v/v) triethylamine and 93.7% (w/v) of aqueous solution (pH = 5.0). The calibration curve for quercetin-3-O-sophoroside was linear in the range of 0.1 - 10.0 μg·mL-1(r = 0.998 4). The intra-day and inter-day precision (RSD) were below 4.9% and the limits of detection (LOD) was 0.1 μg·mL-1(S/N = 10). The average rate of recovery was 96.3% and RSD was 5.1%. The pharmacokinetic course of quercetin-3-O-sophoroside in rats fitted the two-compartment model. The relavent pharmacokinetic parameters were as follows: t1/2α= 7.3 min, t1/2β= 28.7 min, АUC = 804.37 μg·min-1·mL-1, Vd= 0.325 μg·mL-1, MRT = 25.8 min. Conclusion: The microemulsion liquid chromatography method was successfully applied to determine the concentration of quercetin-3-O-sophoroside in rat cerebrospinal fluid and to the pharmacokinetics research in rats.