夏枯草提取物對Jurkat淋巴瘤細胞凋亡影響的體外實驗研究

馬耀臻，孫振昌，付曉瑞，蘭　宣，張明智

(鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

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夏枯草提取物對Jurkat淋巴瘤細胞凋亡影響的體外實驗研究

馬耀臻，孫振昌，付曉瑞，蘭宣，張明智

(鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

[摘要]目的探討夏枯草提取物對Jurkat細胞凋亡的影響。方法瓊脂糖凝膠電泳法檢測Jurkat細胞發生的DNA降解；流式細胞儀分析Jurkat細胞經不同濃度夏枯草提取物處理48 h后的細胞凋亡率。結果DNA瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：各實驗組出現明顯的DNA梯形凋亡條帶，而空白對照組無DNA梯形凋亡條帶出現；流式細胞Annexin V/PI法檢測細胞凋亡：夏枯草提取物(18 μg·mL(-1)、26 μg·mL(-1)、34 μg·mL(-1))處理Jurkat細胞48 h后，凋亡早期細胞在空白對照組占3.07%，在18 μg·mL(-1)組占7.58%，在26 μg·mL(-1)組占19.39%，在34 μg·mL(-1)組占34.16%。結論夏枯草提取物能夠誘導Jurkat細胞的凋亡。

[關鍵詞]夏枯草；淋巴瘤；Jurkat細胞；細胞凋亡

淋巴瘤發病率逐年上升，以化療為主的綜合治療仍是目前治療淋巴瘤的主要手段，迄今用于臨床的化療藥物毒副反應較重，尤其是對骨髓造血功能的抑制作用常常會導致化療中斷，而原發或繼發耐藥往往導致化療失敗。

因此，尋求高效低毒的抗腫瘤藥物是目前腫瘤治療的主要研究內容之一。夏枯草作為一種傳統的中草藥，具有清火明目、軟堅散結之功效。有關其抗腫瘤作用有較多的報道，如應用夏枯草治療甲狀腺癌、淋巴肉瘤、腮腺癌、扁桃腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌等由來已久。現代藥理學研究證明夏枯草具有廣泛的藥理活性。在體外腫瘤細胞凋亡實驗中提示該藥能誘導人胃癌SGC-7901細胞、小鼠T淋巴瘤EL-4細胞及人紅白血病K562細胞的凋亡[1]。但是，夏枯草抗腫瘤有效提取物的抗腫瘤作用機制有待進一步深入研究。

1材料與方法

1.1細胞株人T淋巴瘤Jurkat細胞，購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。

1.2藥物與試劑夏枯草(產地：河南確山，提取物由鄭州大學藥學院提取)干燥成熟果穗經醇煎及一系列萃取、蒸餾、干燥等過程提取而成等；RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(天津TBD血液研究所)；磷脂結合蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(propidine iodide，PI)凋亡檢測試劑盒(美國Bender MedSystems公司)。

1.3主要儀器96孔培養板(美國Costar公司)，微量移液器(芬蘭Biohit公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)，DG5031型酶聯免疫檢測儀(南京華東電子醫療裝備有限責任公司)，DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，U-2001型紫外分光光度儀(美國Startorius公司)，PAS型流式細胞儀(德國Partec公司)。

2方法

2.1夏枯草提取物對Jurkat細胞影響的片段化分析

2.1.1提取DNA收集夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)及生理鹽水處理48 h后的Jurkat細胞，UNIQ-10柱提取基因組DNA[2]。

2.1.2瓊脂糖凝膠電泳用1×TBE緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，加入10 mg·mL-1溴化乙啶制膠，取DNA樣品7 μL與上樣緩沖液按5:1混勻后電泳(恒壓55 V，1 h)，成像系統分析并拍照。

2.2流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡

2.2.1實驗分組實驗組：不同濃度夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)處理48 h后的Jurkat細胞。對照組：加入等體積的生理鹽水。

2.2.2制備單細胞懸液取不同組別Jurkat細胞經流式細胞儀檢測。流式細胞儀測定細胞凋亡的結果判定：凡細胞出現細胞膜受損，且Annexin V(+)/PI(-)的細胞為早期凋亡細胞，Annexin V(+)/PI(+)的細胞為晚期凋亡細胞或壞死細胞；Annexin V(-)/PI(-)細胞為正常細胞；Annexin V(-)/PI(+)為壞死細胞。細胞凋亡率=Annexin V(+)/PI(-)細胞數+ Annexin V(+)/PI(+)細胞數/檢測細胞數×100%。

2.2.3流式細胞儀分析單染PI法使用單通道620 nm綠色熒光檢測細胞，雙染Annexin V/PI法分別以525 nm、620 nm紅色熒光和綠色熒光檢測細胞，經流式細胞儀的Partec FloMaX測量軟件檢測每個樣品20 000個細胞。單染PI法采用Partec FloMaX軟件分析20 000個細胞中凋亡細胞所占的比率。雙染Annexin V/PI法直接測得每個樣本20 000個細胞中正常細胞、早期凋亡、晚期凋亡、死亡細胞所占的比例。

2.3統計學處理用SPSS 17.0處理相關數據，計數資料采用百分數表示，比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1夏枯草提取物誘導Jurkat 細胞凋亡的作用不同濃度的夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)處理Jurkat細胞48 h后引起細胞凋亡，DNA瓊脂糖凝膠電泳出現明顯的DNA梯形凋亡條帶(DNA ladder band)，提示DNA在核小體間斷裂，呈細胞凋亡的典型特征，而培養時間相同的空白對照組無DNA梯形凋亡條帶出現。見圖1。

圖1　不同濃度夏枯草提取物

1：加藥34 μg·mL-1組，DNA加樣量7 μL；2：加藥26 μg·mL-1組，DNA加樣量7 μL；3：加藥18 μg·mL-1組，DNA加樣量7 μL；4：空白對照組，DNA加樣量7 μL

2.2夏枯草提取物處理Jurkat細胞48 h后流式細胞儀檢測細胞凋亡將Annexin V與PI匹配使用，利用流式細胞儀分別檢測不同濃度的夏枯草提取物作用于Jurkat細胞在48 h后的凋亡百分率。1)活細胞在空白對照組占91.23%；在18 μg·mL-1組占88.25%；在26 μg·mL-1組占47.04%；在34 μg·mL-1組占10.52%。隨著作用濃度的增加，活細胞數量逐漸減少。26 μg·mL-1和34 μg·mL-1組與空白對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；2)凋亡早期細胞在空白對照組占3.07%；在18 μg·mL-1組占7.58%；在26 μg·mL-1組占19.39%；在34 μg·mL-1組占34.16%。隨著作用濃度的增加，凋亡細胞數量增加。26 μg·mL-1和34 μg·mL-1組與空白對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2　夏枯草提取物處理Jurkat細胞不同濃度的細胞凋亡率變化

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注：26 μg·mL-1組、34 μg·mL-1組與空白對照組比較，P<0.05；各實驗組兩兩比較，P均<0.05

3討論

誘導細胞凋亡是目前研究最為熱點的中草藥抗腫瘤機制。越來越多的研究[1-2]表明，中草藥抗腫瘤的療效與中草藥誘導腫瘤細胞凋亡有關。細胞凋亡是一種有別于細胞壞死的，細胞主動參與并遵循一定程序的自我消亡過程，是多細胞有機體為調控有機體發育，維持內環境穩定，由基因控制的細胞主動死亡過程[3-4]。有學者認為細胞凋亡又稱程序性死亡，但嚴格說來，兩者不是指的同一現象，程序性死亡是功能上的概念，凋亡是形態上的概念，并不是所有的程序性死亡都表現為細胞凋亡的形態學特征[5]。細胞凋亡不僅對胚胎發生、器官發育、變態反應及保持機體自穩等過程至關重要，而且通過細胞凋亡，機體能及時清除過多的、受損的或惡變的細胞。正常的細胞凋亡被抑制，可能是各種惡性腫瘤和自身免疫性疾病的重要發病機制。細胞凋亡具有特殊的形態和生化特征。形態學特點表現為：首先是胞體縮小，失去微絨毛，與周圍細胞失去聯系，細胞器變致密，核體積縮小，核仁消失，染色質濃集于核膜表面，形成新月形致密小斑塊；接著染色體斷裂，核膜和細胞膜均內陷，自行分割為多個外有膜包裹、內含物不外溢的凋亡小體，最終被鄰近細胞所識別、吞噬。

研究細胞凋亡的方法有很多。形態學觀察是檢測細胞凋亡最可靠的方法，主要是通過光學顯微鏡和電子顯微鏡，對組織或細胞進行各種染色，如HE染色、甲基綠-呱諾寧染色、Giemas染色等。在普通光學顯微鏡下常用熒光染料如叮嚨橙、Heochst33258染色在熒光顯微鏡下觀察;或制成超薄切片用電子顯微鏡觀察，以區別細胞凋亡和壞死。但這些傳統的方法僅局限在大體形態上，遠不能勝任精確的定性、定量，因此，限制了其應用。

而其他的凋亡生化特征的檢測方法有：TUNEL檢測法、ELISA檢測法、DNA凝膠電泳法、Annexin V與PI雙染檢測細胞凋亡法。1)TUNEL檢測法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確反映細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離細胞的細胞形態測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞和早期凋亡，缺點是因需固定細胞可出現DNA片段丟失；2)DNA凝膠電泳法的原理是凋亡細胞DNA斷裂點均有規律的發生在核小體之間，出現180～200 bp DNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的死亡，并可與壞死細胞區別，缺點是定量較困難；3)ELISA檢測法敏感性高，可檢測5～100 ·mL-1個凋亡細胞，不需要特殊儀器，操作方便，但是不能精確測定凋亡細胞發生的絕對量；4)Annexin V與PI雙染檢測細胞凋亡法的原理是細胞在正常生存狀態下，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin V是一種Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。PI是一種核酸染料，其不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的Annexin V對細胞染色，可使早期凋亡細胞膜外表面暴露的PS于Annexin V/FITC特異性結合而出現綠色熒光，但細胞仍維持其細胞膜的完整性，使變性染色質著色的熒光染料PI不能進入細胞，然而壞死或凋亡晚期的繼發性壞死細胞可同時受Annexin V和PI標記，借助流式細胞儀可定量分析受標記的凋亡壞死細胞數。此方法不需固定細胞，因此，操作方便，更加省時，結果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡定性與定量的方法。

本研究中，DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示，不同濃度的夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 g·mL-1、34 μg·mL-1)作用于Jurkat細胞48 h后引起細胞凋亡，電泳可見明顯的DNA梯形凋亡條帶，且隨藥物濃度的增加，凋亡帶逐漸變寬，而空白對照組無DNA梯形凋亡條帶出現。不同濃度夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)作用Jurkat細胞48 h后，細胞凋亡率逐漸升高，呈劑量依賴性。其中18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1組活細胞分別為88.25%、47.04%、10.52%；早期細胞凋亡率分別為7.58%、19.39%、34.16%，26 μg·mL-1組和34 μg·mL-1組與空白對照組比較差異均有統計學意義。

上述結果提示，夏枯草提取物可誘導Jurkat細胞凋亡，這可能是其抗腫瘤作用機制。

參考文獻：

[1]張明智,鄭曉珂,劉宏民.夏枯草提取物體外誘導EL-4細胞凋亡的實驗研究[J].江蘇中醫藥,2008,40(4):80-83.

[2]孫振昌,付曉瑞,崔瑩瑩,等.夏枯草提取物作用Jurkat細胞的分子生物學研究[J].中藥材，2014，37(8)：1441-1444.

[3]劉新奎,王琳,張明智.JNK和Caspase-3在夏枯草引起人淋巴瘤細胞凋亡中的作用[J].中華醫學雜志,2010,90(10):690-693.

[4]張明智,孫振昌,付曉瑞,等.夏枯草提取物作用Jurkat細胞的蛋白質組學研究[J] .中藥材，2009，32(6)：917-922.

[5]付曉瑞，孫振昌，張明智.夏枯草提取物誘導B、T淋巴瘤細胞凋亡的實驗研究[J].中藥材，2012，35(3)：433-438.

Effects of Selfheal Extract on Jurkat Cell Apoptosis

Ma Yaozhen, Sun Zhenchang, Fu Xiaorui, Lan Xuan, Zhang Mingzhi

(DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of selfheal extract on Jurkat cell apoptosis.MethodsDetect the DNA degradation of Jurkat cells exposured to different concentration of selfheal extract through agarose gel electrophoresis and analyze cell apoptosis rate by flow cytometry after 48 hours.ResultsAgarose gel electrophoresis of the DNA showed typical DNA ladder in the experimental groups, which wasn’t observed in the blank control group; Annexin V/PI by flow cytometry to detect cell apoptosis revealed that early apoptosis cells rate of Jurkat cells exposured to selfheal extract with the concentration of 18 μg·mL(-1), 26 μg·mL(-1), 34 μg·mL(-1) accounted for 7.58%,19.39%,34.16% respectively compared with 3.07% in the blank control group after 48 hours.ConclusionThe selfheal extract can induce the apoptosis of Jurkat cells.

[Key words]selfheal; lymphoma; Jurkat cells; cell apoptosis

(收稿日期：2015-10-12)

[中圖分類號]R733.1；R730.23

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2016)02-0106-04

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2016.02.004

作者簡介：馬耀臻(1990-)，男，碩士，主要從事淋巴瘤的基礎與臨床研究。通信作者：張明智(1962-)，男，教授，主任醫師，博士生導師，主要從事淋巴瘤的基礎與臨床研究。E-mail：mingzhi_zhang@126.com