熊果酸對人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖和凋亡的影響

王麗琴

(武安市第一人民醫(yī)院婦科，河北 武安　056300)

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熊果酸對人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖和凋亡的影響

王麗琴

(武安市第一人民醫(yī)院婦科，河北 武安056300)

摘要：目的研究熊果酸(UA)對人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。方法將處于對數(shù)生長期人上皮性卵巢癌SKOV3細胞隨機分為5組：正常對照組、熊果酸(40、20、10 mg·L(-1))干預(yù)組和順鉑(40 mg·L(-1))干預(yù)組(陽性對照組)。藥物干預(yù)48 h后，通過四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定細胞增值抑制率；通過流式細胞儀分析細胞周期的改變、觀察細胞凋亡并計算細胞凋亡率；通過RT-PCR技術(shù)檢測細胞Bax mRNA和bcl-2 mRNA表達并計算Bax/bcl-2表達比值，Western blot法檢測細胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表達并進行半定量分析。結(jié)果較正常對照組，熊果酸(40、20 mg·L(-1))干預(yù)組細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.01)，細胞周期被阻滯于G2/M期，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；熊果酸(40、20 mg·L(-1))干預(yù)組細胞中bcl-2 mRNA表達顯著下調(diào)、Bax mRNA表達顯著上調(diào)，Bax/bcl-2表達比值顯著升高(P<0.01)，caspase-3蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論熊果酸具有抑制人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖并促進其凋亡的作用，其作用機制可能與熊果酸能夠有效下調(diào)bcl-2 mRNA表達、上調(diào)Bax mRNA表達、提高Bax/bcl-2表達比值以及上調(diào)caspase-3蛋白表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞：熊果酸；上皮性卵巢癌；SKOV3細胞；增殖；凋亡

由于早期診斷率低，卵巢癌死亡率高居眾多婦科惡性腫瘤之首，年死亡率約9.5/10萬[1]。目前，臨床上主要采取手術(shù)清除結(jié)合術(shù)后化療的手段治療卵巢癌，能夠相對延長患者生命，但3年復(fù)發(fā)率仍高于50%，5年生存率仍不到30%；學(xué)者[2-3]研究發(fā)現(xiàn)，耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一。因此，研發(fā)藥效優(yōu)良且抗耐藥的新型藥物是延緩卵巢癌的關(guān)鍵。熊果酸(Ursolic Acid, UA)是一種天然存在的五環(huán)三萜類化合物，主要存在于熊果、夏枯草、女貞子等植物中。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，熊果酸具有抗氧化、抗炎、降血脂、抗病毒等多種生物活性[4-5]，毒副作用低，具有良好的臨床應(yīng)用開發(fā)前景。本實驗通過使熊果酸干預(yù)人上皮性卵巢癌SKOV3細胞，并以順鉑干預(yù)組為陽性對照，研究熊果酸對人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。

1材料與方法

1.1藥物與試劑熊果酸(陜西慧科植物開發(fā)有限公司，批號：140519，純度≥98%)；注射用順鉑(山東齊魯制藥有限公司，每支10 mg)；PBS溶液(博士德太原分公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國JRH公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；四甲基偶氮唑鹽試劑盒(MTT，美國Sigma公司)；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒(德國Bendermed公司)；RNA提取TRIzol試劑盒(北京TransGen公司)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海斯信生物科技有限公司)；bcl-2、bax的上下游引物(上海博亞生物公司)；羊抗人caspase-3單體(碧云天生物技術(shù)有限公司)；SP法試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其余試劑均為分析純。

1.2細胞人上皮性卵巢癌SKOV3細胞株由北京腫瘤醫(yī)院惠贈。

1.3主要儀器超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；BB5060/BB16型恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(美國forma scientific公司)；iMark型酶標(biāo)儀、PCR儀(美國 Bio-Rad公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；DYY-11 型多用電泳儀、DYCZ-40B 轉(zhuǎn)印泳槽(北京六一儀器廠)；倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4方法

1.4.1細胞培養(yǎng)與分組將實驗用細胞株經(jīng)解凍復(fù)蘇后置于RPMI-1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待細胞生長繁殖至對數(shù)生長期，去培養(yǎng)液加0.25%胰酶進行消化，調(diào)整細胞濃度至5×107·L-1，培養(yǎng)24 h后隨機分為正常對照組、熊果酸(40、20、10 mg·L-1)干預(yù)組和順鉑(40 mg·L-1)干預(yù)組(陽性對照組)，每組均給藥干預(yù)48 h后進行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.4.2細胞增值抑制率測定調(diào)整細胞濃度至5×107·L-1后接種于96孔板，每組設(shè)10個復(fù)孔，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，培養(yǎng)4 h后去上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 200 μL，振蕩10 min后通過酶標(biāo)儀測定波長570 nm處吸光度(OD)值，然后計算各組細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.4.3細胞周期及細胞凋亡的檢測取約1×106細胞，10 000 rpm離心5 min后棄上清液，PBS洗滌，加70%乙醇5 mL混勻，于4℃環(huán)境放置48 h后，離心去除乙醇，PBS洗滌后1 mL PBS溶液打散細胞團后加5 μL水解酶Rnase(10 g·L-1)，37℃放置1 h后加入碘化丙啶(100 mg·L-1)染液，室溫避光孵育30 min，然后通過FACS-FITC和PI聯(lián)合染色流式細胞儀進行分析檢測，采用CELL Quest軟件分析各組細胞的細胞周期時相及凋亡狀況。

1.4.4細胞中bcl-2 mRNA、bax mRNA表達的檢測及Bax/bcl-2表達比值的計算從基因文庫中查詢大鼠bcl-2、bax基因cDNA序列，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計上、下游引物；bcl-2引物：上游5'-GGGATGCCTTTGTGGAACTA-3'，下游5'-TGATTTGACCATTTGCCTGA-3'；bax引物：上游5'-ATCCAGGATCGAGCAGGGAGGATGG-3'，下游5'-AGATGGTCACTGTCTGCCA TGTGGG-3'；β-actin引物：上游5'-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3'，下游 5'-CCATCTCTTG CTCGAAGTCT-3'。經(jīng)藥物干預(yù)48 h后，經(jīng)0.25%胰酶消化并收集各組細胞，加入適量TRIzol試劑提取總RNA并測定總RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR反應(yīng)，擴增完畢后取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，最后通過凝膠成像儀觀察并照相。以β-actin為內(nèi)參，半定量分析bcl-2 mRNA、bax mRNA表達，計算Bax/bcl-2表達比值。

1.4.5細胞中caspase-3蛋白表達的檢測離心取各組細胞，經(jīng)PBS溶液洗滌3次后超聲碎裂細胞，12 000 rpm低溫(4℃)離心20 min取沉淀，通過BCA法進行蛋白定量，蛋白變性后上樣、電泳：待溴酚藍接近膠底部時停止、轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(caspase-3，β-actin) 4℃過夜；洗膜，二抗室溫?fù)u床上孵育1 h后經(jīng)ECL顯色，實驗結(jié)果應(yīng)用Quantity One軟件進行分析。

2結(jié)果

2.1熊果酸對細胞增殖抑制率的影響熊果酸各干預(yù)組和順鉑干預(yù)組SKOV3細胞增殖抑制率較正常對照組均顯著升高(P<0.01)；且熊果酸40 mg·L-1干預(yù)組SKOV3細胞增殖抑制率顯著高于順鉑干預(yù)組(P<0.05)，結(jié)果見表1。

表1　熊果酸對人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與順鉑干預(yù)組比較，△P<0.05。

2.2熊果酸對細胞細胞周期的影響熊果酸(40、20 mg·L-1)干預(yù)組和順鉑干預(yù)組SKOV3細胞G0/G1期較正常對照組顯著縮短且G2/M期顯著延長(P<0.01)，但熊果酸(40、20 mg·L-1)干預(yù)組和順鉑干預(yù)組間無顯著性差異(P>0.05)，提示熊果酸能夠?qū)KOV3細胞周期阻滯于G2/M期，從而抑制細胞增殖，結(jié)果見表2。

2.3熊果酸對細胞凋亡的影響通過流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，熊果酸干預(yù)組和順鉑干預(yù)組人上皮性卵巢癌SKOV3細胞凋亡狀況較正常對照組明顯加重，見圖1；計算凋亡率發(fā)現(xiàn)，熊果酸各干預(yù)組和順鉑干預(yù)組細胞凋亡率均顯著升高(P<0.01)，且熊果酸40 mg·L-1干預(yù)組細胞凋亡率較順鉑干預(yù)組顯著升高(P<0.01)，結(jié)果見表3。

表2　熊果酸對人上皮性卵巢癌SKOV3細胞

圖1　熊果酸對人上皮性卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響

注：A.正常對照組；B.熊果酸40 mg·L-1干預(yù)組；C.熊果酸20 mg·L-1干預(yù)組；D.熊果酸10 mg·L-1干預(yù)組；E.順鉑40 mg·L-1干預(yù)組。

表3　熊果酸對人上皮性卵巢癌SKOV3細胞

注：與正常對照組比較：**P<0.01；與順鉑干預(yù)組比較：△△P<0.01。

2.4熊果酸對細胞中bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達和Bax/bcl-2表達比值的影響通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，熊果酸40 mg·L-1干預(yù)組bcl-2 mRNA表達較正常對照組顯著降低(P<0.01)，而熊果酸(40、20 mg·L-1)干預(yù)組和順鉑干預(yù)組Bax mRNA表達均顯著升高(P<0.01)、Bax/bcl-2比值顯著升高(P<0.01)；熊果酸40 mg·L-1干預(yù)組Bax/bcl-2表達比值較順鉑干預(yù)組顯著升高(P<0.05)，結(jié)果見表4。

2.5熊果酸對細胞caspase-3蛋白表達的影響通過Western blot方法測定細胞中caspase-3蛋白表達：發(fā)現(xiàn)熊果酸(40、20 mg·L-1)干預(yù)組和順鉑干預(yù)組人上皮性卵巢癌SKOV3細胞caspase-3蛋白表達量較正常對照組顯著升高(P<0.01)；且熊果酸40 mg·L-1干預(yù)組細胞中caspase-3蛋白量顯著高于順鉑干預(yù)組(P<0.05)，結(jié)果見圖2和表5。

表4　熊果酸對人上皮性卵巢癌SKOV3細胞

注：與正常對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與順鉑干預(yù)組比較：△P<0.05。

圖2　熊果酸對人上皮性卵巢癌

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與順鉑干預(yù)組比較，△P<0.05。

3討論

卵巢癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見三大惡性腫瘤，其中卵巢癌的發(fā)病率居第2位；但由于早期診斷率低，年死亡率達9.5/10萬，居眾多婦科惡性腫瘤之首[6]。目前，臨床上對于卵巢癌的治療仍以手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后化療為主，但5年生存率不足30%，其中腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一[2-3, 7]。因此，迫切需要研發(fā)療效良好且抗耐藥的新型藥物。

熊果酸(Ursolic Acid, UA)是一種具有多種藥理學(xué)活性的五環(huán)三萜類化合物。近年來關(guān)于熊果酸抗癌活性的研究越來越受到廣大學(xué)者的灌注，張明發(fā)[8]和黃之虎[9]等研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸能夠通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達而誘導(dǎo)白血病細胞凋亡；徐新偉[10]和馬于平[11]等通過熊果酸干預(yù)乳腺癌細胞進行研究，發(fā)現(xiàn)熊果酸能夠抑制乳腺癌細胞增殖并促進其凋亡。本研究以人上皮性卵巢癌SKOV3細胞株為受試細胞并以順鉑干預(yù)組為陽性對照進行研究，MTT實驗結(jié)果顯示，經(jīng)熊果酸干預(yù)能夠顯著提高SKOV3細胞增殖抑制率，并且熊果酸40 mg·L-1干預(yù)組效果顯著優(yōu)于順鉑干預(yù)組；流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，經(jīng)熊果酸干預(yù)能夠?qū)KOV3細胞阻滯于G2/M期并提高SKOV3細胞凋亡率，并且熊果酸40 mg·L-1干預(yù)組細胞凋亡率顯著高于順鉑干預(yù)組，提示熊果酸具有抑制人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖并促進其凋亡的作用。

bcl-2和Bax均為bcl-2基因家族成員，其中bcl-2為凋亡抑制基因、Bax為促凋亡基因，二者相互作用、共同調(diào)控細胞凋亡[12-13]；并且細胞凋亡不僅僅與bcl-2和Bax基因表達密度相關(guān)，甚至更依賴于bcl-2/Bax表達比值[14]。Caspases基因家族是細胞凋亡過程中非常重要的調(diào)控基因，其中caspase-3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的關(guān)鍵蛋白酶。本研究結(jié)果顯示，熊果酸能夠顯著下調(diào)人上皮性卵巢癌SKOV3細胞中bcl-2基因表達、同時上調(diào)Bax基因表達、提高Bax/bcl-2表達比值，并上調(diào)caspase-3蛋白表達，這可能是熊果酸抑制人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖并促進其凋亡作用重要的分子機制之一。

因此，熊果酸具有抑制人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖并促進其凋亡的作用；其作用機制可能與熊果酸能夠有效下調(diào)bcl-2 mRNA表達、上調(diào) Bax mRNA表達、提高Bax/bcl-2比值以及上調(diào)caspase-3蛋白表達有關(guān)。

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Effects and mechanism of ursolic acid on the proliferation and apoptosis of epithelial ovarian SKOV3 cancer cell

WANG Li-qin

(DepartmentofGynecology,Wu’anFirstPeople’sHospital,Wuan,Hebei056300,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of ursolic acid(UA) on the proliferation and apoptosis of epithelial ovarian SKOV3 cancer cell. Methods The Logarithmic epithelial ovarian cancer SKOV3 cells were randomized into five groups:normal control group, UA(40、20、10 mg·L(-1)) groups and Cisplatin 40 mg·L(-1) group. 48 h later, the cellular growth inhibition rate was calculated by MTT, cell cycle and apoptosis rates were analyzed by flow cytometry, the expression of Bax mRNA and bcl-2 mRNA were detected by RT-PCR, the level of caspase-3 protein expression was detected by Western blot. ResultsCompared with normal control group, the cellular growth inhibition rates of UA(40、20 mg·L(-1)) groups were significantly increased(P<0.01); the cell cycle was arrested at G2/M phase, the apoptosis rate was significantly increased(P<0.01); the expression of bcl-2 mRNA was significantly decreased, while the expression of Bax mRNA was significantly increased, and the ratio of Bax/bcl-2 was significantly increased(P<0.01); the expression of caspase-3 protein was significantly increased (P<0.01). ConclusionsUA could effectively inhibit epithelial ovarian SKOV3 cancer cell proliferation and promote its apoptosis, which was perhaps related to its effects of downregulating the expression of bcl-2 mRNA, raising the expressions of Bax mRNA and caspase-3, and enhancing the ratio of bcl-2/Bax.

Key words:ursolic acid;epithelial ovarian cancer;SKOV3 cell;proliferation; apoptosis

(收稿日期：2015-11-10，修回日期：2016-01-12)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.009