金屬硫蛋白突變體的煙草植物高效表達載體探討

劉晨

摘 要：金屬硫蛋白通常由α和β兩個結構域組成，其中α的結構域構成包括Cd2+和Hg2+，小鼠突變體則在大腸桿菌中進行搭建，并獲得了轉基因植株。為了更好地增強外源基因在煙草中的表達效果，可以在基因起始密碼子ATG附近融入適合植物需要的堿基組合AACAATG，這種組合有利于將突變體基因插入具有35S強啟動子的植物雙元表達載體pGPTVd35S-BAR中，并獲得αα突變體的植物雙元表達載體。在本次研究中，將采用PCR-Southern和蛋白Dot-blotting檢測方法，證明αα突變體可以在煙草中良好地表達。同時，在抗重金屬的實驗中證明轉基因煙草能夠在Cd400中良好的生長。

關鍵詞：金屬硫蛋白突變體 植物高效表達載體 煙草 轉基因

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2016）4（c）-0000-00

現階段，我國植物基因工程技術得到了全面的發展，外源基因通過不同的方法進入植物體中。尤其是使用轉入外源基因的方式能夠有效地提高植物吸附重金屬的能力，有利于解決環境污染問題。在工農業文明持續發展的過程中，廢水、廢氣、廢渣及農藥的不合理使用對環境資源造成了嚴重的損害，其中重金屬污染主要以Cd2+、 Hg2+、Pb2+為主。它們在食物鏈的循環過程中將會影響人類的生命健康。除此之外，在自然界中金屬硫蛋白（MT）發揮著至關重要的作用，這也是本文探討的主要方向。

1 金屬硫蛋白的基本概念

金屬硫蛋白是一類低分子量富含半胱氨酸的金屬結合蛋白，可以結合排除體內過量的重金屬物質。與此同時，在植物界存在一類多肽物質，即植物絡合態，它是一種酶促合成的產物，在重金屬大量存在的時候會有全新的表達。除此之外，植物本身對重金屬的抵抗能力是有限的，需要通過植物轉基因技術將金屬硫蛋白基因轉入植物體內。

金屬硫蛋白通常由α和β兩個結構域組成，其中α的結構域構成包括Cd2+和Hg2+，在構建MT重組體αα的過程中，其中β結構域被α結構域所代替，通過實驗我們認為αα的穩定性與天然MT相同。因此，當我們在考慮將αα轉基因放入植物體內時，可以優化植物對重金屬的承受力。在該方面的研究中，我們認為重金屬的含量與植物體內的αα基因的蛋白量成正相關關系，并證實了轉入αα基因的煙草對Cd2+有較好的抵抗性。

2 金屬硫蛋白突變體的植物高效表達載體的實驗探究

2.1 材料與方法

本次實驗我們選取了含有小鼠MT重組體的αα基因cDNA質粒pBSαα、質粒pUC18、農桿菌LBA4404、helper質粒pRK2013，在酶和試劑的選擇上包括EcoRⅠ、HindⅢ、XbaⅠ、SacⅠ、T4 DNA ligase等。

其探究方法包括以下幾個步驟。首先，我們需要將PCR擴增αα基因，即以pBSαα為模板，得到PCR后加入突變位點的ααcDNA基因。隨后需要搭建pUC18αα測序載體，并使用baⅠ/SacⅠ雙酶切去磷酸化，保存，2%片段進行定向克隆到酶切過的pUC18中完成酶切鑒定。與此同時，搭建植物高效表達式載體，將準備好的35 S的質粒pBI426及植物表達載體pGPTV-BAR用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切，在去磷酸化之后完成酶切篩選。值得注意的是，在該載體搭建的過程中需要按照正確的測序順序進行，并搭建與pGPTVd35S載體相同的酶XbaⅠ/SacⅠ酶切。除此之外，我們還要對含有αα轉基因的植株和PCR進行PCR-Southern鑒定，即通過農桿菌介導的葉盤法轉化煙草NC89獲得抗除草劑植株，并提取煙草葉DNA，在分離純化之后進行PCR擴增。最后，我們將完成對含有αα基因的轉基因植株的蛋白Dot-blot鑒定。具體為：將葉片經液氮處理并研磨成粉末，并研制成漿液，取清液Bio-Rad點樣器點樣于NC膜上，取總蛋白量100μg上清點樣于孔中，隨后抽濾為真空狀態，進行抗體抗血清反應。

2.2 結果

在 PCR產物的酶切及鑒定上，由于αα為兩個重復的片段，所以出現了兩條帶。在PCR回收的片斷XbaⅠ/SacⅠ雙酶切后進行了藍白斑的篩選，且酶切結果顯示為陽性克隆。隨后，完成35S啟動子植物表達載體的構建，具體表達如圖1所示。

圖1 35S啟動子植物表達載體的構建示意圖

與此同時，在轉基因植株的PCR、PCR-Southern鑒定上，我們提取了煙草葉的DNA并進行PCR擴展，以αα的兩端為5和3引物，其反應體系可為25?I。引起該反應的基本條件為96℃ 5 min，94℃ 5 min，60℃ 1 min，72℃ 2 min為一個循環，然后進入30個循環； 94℃ 1 min，60℃ 1min，72℃ 2 min，最后72℃延伸10 min。這是由于αα是重復的基因，在PCR時得到的兩條帶分別為119bp和215bp。當我們對該片段進行稀釋后可使用1.5%瓊脂糖膠分離轉尼龍膜，完成雜交過程。

在轉基因植株抗性實驗上，每種濃度的試劑都有6-8棵植株樣本，并進行為期30天的觀察。具體而言，需要將培養的生根植株移栽到不同濃度梯度的Cd2+培養容器中，經過30天的培養，Cd200的培養容器內轉基因煙草的生長狀態顯示為正常；Cd300的轉基因植株其內根系相對正常，但是比起Cd200的植株根系較為短粗；Cd400的轉基因煙草的根系少數顏色為褐色，且葉片輕微發黃，總體生長正常。對照煙草植株的根系在Cd200時就無法正常生存。

2.3 討論

使用PCR方法進行實驗探究，并以pBS-αα為模板得到了起始密碼子ATG前加上AACA四個堿基的突變體基因。通過裝入測序載體驗證了序列的正確性。因此，我們認為提高外源基因在植物體中的表達，建立高效的表達載體和較強的啟動子具有重要的參考價值。即在pGPTVd35S表達載體構建的過程中，Gus npt基因的上游有兩個串聯的35S啟動子和AMV序列，下游則是Nos終止子。除此之外，該載體還包含了Pnos啟動子驅動的bar基因。綜上所述，我們認為轉基因煙草可以用除草劑來進行初步篩選。當我們利用XbaⅠ/SacⅠ切掉Gus npt基因后，插入測序正確的αα突變體基因時便得到了植物雙元表達載體。根據雙子葉植物的密碼子，改變堿基，并將密碼子的使用頻率由原先的44%提升到56%，5引物中的原TGT改為TGC，3引物中原AGG改為現在的AGT，證明了啟動子強弱對外源基因表達有直接影響，且處于關鍵位置。與此同時，植物對堿基的偏愛主要受到特定堿基組合的干擾，即可以提高mRNA的穩定性以及蛋白翻譯的起始頻率。此外，在優化高效表達的過程中，我們進行了以下三部分的調整，包括：轉錄水平調控35S-35S；轉譯水平的調控AMV基因的5-非轉譯序列；轉譯水平調控改變ATG附近位置的堿基組成。

3 結語

本文綜合考慮了影響植物體的多種因素，優化各項條件和環境，從而搭建了αα突變體基因的植物高效表達載體，并成功獲得了轉基因植株。在初步檢驗的過程中有效地證明了外源基因已嵌合。對于已經生根的植株的移植方面，說明在Cd400的培養濃度下可以正常地生長，其它的抗性實驗仍有很大的發展空間。

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