P-JAK2/P-STAT3與突變型p53蛋白在宮頸病變中的表達及臨床意義

馬慧，尹利榮△，王芳，李洪林，單舒

?

P-JAK2/P-STAT3與突變型p53蛋白在宮頸病變中的表達及臨床意義

馬慧1，尹利榮1△，王芳2，李洪林2，單舒2

摘要:目的探討宮頸病變中磷酸化JAK激酶2（P-JAK2）、磷酸化信號轉導與轉錄因子3(P-STAT3)及突變型p53蛋白的表達及其臨床意義。方法選取我科收治的宮頸鱗癌（SCC組）57例、低級別上皮內瘤變（LSIL組）36例、高級別上皮內瘤變（HSIL組）30例和正常宮頸（NC組) 30例為研究對象，檢測各組高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染情況，行HE染色、免疫組化檢測P-JAK2、P-STAT3及突變型p53蛋白表達情況。結果（1）SCC組的HRHPV感染率、P-JAK2陽性表達率高于HSIL組、LSIL組及NC組(P＜0.05 )。（2）SCC組的P-STAT3、突變型p53陽性表達率高于LSIL組、NC組(P＜0.05 )，與HSIL組比較差異無統計學意義。（3）SCC組的P-JAK2和P-STAT3的陽性表達率在不同的FIGO分期、組織分化、淋巴結轉移、HR-HPV感染亞組中有明顯差異（均P＜0.05）；突變型p53的陽性表達率在不同的FIGO分期、HR-HPV感染亞組中具有顯著差異（P＜0.05）。（4）SCC組中P-JAK2與P-STAT3、突變型p53的陽性表達率、HR-HPV感染率均呈正相關(P＜0.05)，P-STAT3與突變型p53的表達率、HR-HPV感染率呈正相關(P＜0.05)；突變型p53表達與HR-HPV感染呈正相關(P＜0.05)。結論P-JAK2、P-STAT3與突變型p53蛋白在SCC組中的表達水平高于正常組及上皮內瘤變組，三者可能與HR-HPV感染、宮頸鱗癌發生、進展有關。

關鍵詞：磷酸化JAK激酶2；磷酸化信號轉導與轉錄因子3;突變型p53；宮頸鱗癌；高危型人乳頭瘤病毒；宮頸上皮內瘤變；免疫組織化學

△通訊作者E-mail:yinlirongfk@sina.com

宮頸癌（cervical carcinoma, CC）是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來發病呈年輕化趨勢。世界范圍內，宮頸癌在女性惡性腫瘤發病率中位居第二位，其中以鱗癌為主，約占75%～80%，其致病因素包括人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染、癌基因激活、抑癌基因失活、錯配修復基因突變、端粒酶基因的異常表達及不良生活方式等[1]。JAK激酶2（JAK2）是一種非受體酪氨酸激酶，細胞信號可刺激其磷酸化，作用于信號轉導與轉錄因子3 （STAT3）；STAT3磷酸化后結合于細胞核內特異的DNA位點，作為一種轉錄激活因子調節靶基因的表達，繼而調控細胞增殖、分化和凋亡，與腫瘤發生及發展密切相關[2]。野生型p53是一種與細胞增殖、分化有關的抑癌基因，在修復基因突變、調控細胞周期、促進細胞凋亡等方面具有重要作用，多種癌變組織中存在p53突變[3]。已有研究表明宮頸癌中磷酸化JAK2（P-JAK2）、磷酸化STAT3（P-STAT3）、野生型p53表達及HPV感染之間存在關聯[4]，但是宮頸癌組織中大多數的野生型p53存在突變，目前關于P-JAK2、P-STAT3、突變型p53及高危型HPV（HRHPV）在宮頸病變組織中表達情況的研究較少。本研究通過檢測宮頸病變組織及正常組織中P-JAK2、P-STAT3與突變型p53蛋白的表達及HR-HPV感染情況，以期探討四者與宮頸鱗癌發生、發展的關系及臨床意義。

1　資料與方法

1.1標本來源選取我院婦科2013年12月—2015年6月收治的宮頸鱗癌患者57例（SCC組）、高級別上皮內瘤變（HSIL）患者30例（HSIL組）、低級別上皮內瘤變（LSIL）患者36例（LSIL組），因子宮良性病變行全子宮切除的正常宮頸（NC組)30例為對照。入組患者年齡28～72歲，平均（46.15±3.24）歲，宮頸取材前均未進行放療、化療，無免疫系統疾病、先天性遺傳病、嚴重內科疾病及其他惡性疾病。所有研究對象的臨床及病理資料完整。

1.2試劑HR-HPV基因芯片法檢測試劑盒、鏈霉親和素-過氧化物酶（SP）免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、鼠抗人單克隆抗體p53（突變型，克隆號Do7）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗單克隆抗體P-JAK2（p-Tyr1007/ Tyr1008）購自abcam公司，兔抗人單克隆抗體P-STAT3 （Tyr705 D3A7）購自CST公司。

1.3方法

1.3.1標本收集刷取宮頸上皮脫落細胞，用于檢測HRHPV。鉗取患者宮頸組織，置入有10%福爾馬林溶液的EP管中，石蠟包埋并切片，厚度為4 μm。

1.3.2基因芯片法檢測HR-HPV按照試劑盒操作步驟，提取脫落細胞DNA，PCR擴增目的片段，基因芯片檢測并讀取結果。應用HR-HPV病毒感染分析報告系統檢測HR-HPV各型別，信號位置灰度值與背景灰度值差大于4代表存在該型別HPV感染。

1.3.3HE染色宮頸組織石蠟包塊脫蠟，蘇木素伊紅(HE)染色，脫水、封片。

1.3.4免疫組化按照免疫組化常規方法脫蠟與水化。PBS液沖洗，加3%H2O2去離子水孵育，PBS沖洗，抗原修復，PBS沖洗，正常山羊血清封閉。滴加兔抗單克隆抗體P-JAK2（p-Tyr1007/Tyr1008）、兔抗人單克隆抗體P-STAT3（Tyr705 D3A7）、鼠抗人單克隆抗體p53（突變型，克隆號Do7），4℃過夜。PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記的免疫組化二抗，室溫條件孵育，PBS沖洗，滴加SP。室溫條件孵育，PBS沖洗。加DAB顯色液，自來水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗。常規脫水、透明、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。陰性對照用0.01 mol/L PBS（pH 7.5）代替一抗。

1.3.5免疫組化結果判讀P-JAK2以胞漿中出現背景清晰的棕黃或棕褐色顆粒為陽性，P-STAT3以細胞核或胞漿中出現背景清晰的棕黃或棕褐色顆粒為陽性，突變型p53以細胞核中出現背景清晰的棕黃或棕褐色顆粒為陽性。由2名經驗豐富的病理科醫生雙盲獨立判定結果，若初步診斷不一致，經兩者共同討論決定，若仍未能達成一致意見，則請第3名醫師參與，討論得出一致結論。每例切片選取任意10個400倍視野進行觀察，按染色強度及陽性細胞數百分比綜合計分。染色強度:不著色計0分，淡黃色1分，棕黃色計為2分，棕褐色計3分；陽性細胞百分比:0～5%計0分，6%～20%計1分，21%～50%計2分，50%以上計3分。將染色強度與陽性細胞百分比得分相乘，0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+), 4～5分為中度陽性(++)，≥6分為強陽性(+++)。

1.4統計學方法數據用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料以x ±s表示，組間比較用F檢驗，組間多重比較用SNK-q檢驗。計數資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，相關分析采用Spearman相關。檢驗水準α=0.05,χ2檢驗兩兩比較時采用卡方分割法，并相應校正檢驗水準。

2　結果

2.1HR-HPV感染檢測結果測得HR-HPV基因型主要有：HPV16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、68、73、82型。SCC組的HR-HPV感染率高于其他3組，HSIL組高于LSIL組和NC組(P＜0.008 3)，LSIL組與NC組間差異無統計學意義，見表1。

2.2P-JAK2蛋白在各組中的表達及其與SCC臨床病理特征的關系SCC組的P-JAK2陽性表達率高于其他3組，HSIL組、LSIL組高于NC組，HSIL組與LSIL組差異無統計學意義，見表1。P-JAK2蛋白在SCC組中的表達情況：臨床分期Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期，組織學分級Ⅱ、Ⅲ級高于Ⅰ級，有淋巴結轉移者高于無淋巴結轉移者，有HR-HPV感染者高于無HRHPV感染者，差異均有統計學意義，見圖1、表2。

Tab. 1 Comparison of P-JAK2, P-STAT3 and mutant p53 expression and HR-HPV infection between four groups表1　各組P-JAK2、P-STAT3、突變型p53及HR-HPV感染比較　例（%）

Fig. 1 Expression of P-JAK2 in cervical tissue in four groups (SP，×400)圖1　各組宮頸組織中P-JAK2表達情況(SP，×400)

2.3P-STAT3蛋白在各組中的表達及其與SCC臨床病理特征的關系SCC組的P-STAT3陽性表達率高于LSIL組及NC組，與HSIL組差異無統計學意義。HSIL組高于NC組，LSIL組高于NC組，HSIL組與LSIL組差異無統計學意義，見表1。P-STAT3蛋白在SCC組中的表達情況：臨床分期Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期，組織學分級Ⅲ級高于Ⅰ級；有淋巴結轉移者高于無淋巴結轉移者，有HR-HPV感染者高于無HR-HPV感染者，差異均有統計學意義，見表2、圖2。

2.4突變型p53在各組中的表達及其與SCC臨床病理特征的關系SCC組、HSIL組的突變型p53陽性表達率顯著高于LSIL組、NC組，HSIL組與SCC組、LSIL組與NC組差異無統計學意義。突變型p53蛋白在SCC組中的表達情況：臨床分期Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結轉移者高于無淋巴結轉移者，有HR-HPV感染者高于無HR-HPV感染者，差異均有統計學意義，見表2、圖3。

Tab. 2 Relationship between P-JAK2，P-STAT3, mutant p53 expression and different clinical-pathological characteristics of squamous carcinoma of the cervix表2　不同臨床病理資料宮頸鱗癌患者的P-JAK2、P-STAT3、突變型p53表達情況比較

Fig. 2 Expression of P-STAT3 in cervical tissue in four groups (SP，×400)圖2　各組宮頸組織中P-STAT3表達情況(SP，×400)

2.5SCC組P-JAK2、P-STAT3、突變型p53蛋白表達及HR-HPV感染之間的相關性P-JAK2與PSTAT3、突變型p53及HR-HPV感染均呈正相關，見表3。P-STAT3蛋白與突變型p53蛋白、HR-HPV感染呈正相關，見表4。突變型p53蛋白表HR-HPV感染呈正相關，見表5。

Fig. 3 Expression of mutant p53 in cervical tissue in four groups (SP，×400)圖3　各組宮頸組織中突變型p53表達(SP，×400)

Tab. 3 The association of P-JAK2 expression with the expression of P-STAT3，mutant p53 and HR-HPV infection in SCC group表3　P-JAK2與P-STAT3、突變型p53、HR-HPV 在SCC組中表達的相關性

Tab. 4 The association of P-STAT3 expression with the expression of mutant p53 and HR-HPV infection in SCC group表4　P-STAT3與突變型p53、HR-HPV在SCC組中表達的相關性

Tab. 5 The association of mutant p53 expression with the HR-HPV infection in SCC group表5　突變型p53與HR-HPV感染在SCC組表達的相關性

3　討論

3.1HR-HPV與宮頸病變的關系HR-HPV感染是引發宮頸病變的重要因素。女性初次感染HPV后，可在大約8個月內通過自身免疫力清除，若持續感染HR-HPV超過1～2年，有進展為癌前病變或浸潤癌的風險[5]。An等[6]研究發現，在正常宮頸、LSIL、HSIL、宮頸癌中，HR-HPV病毒的清除率分別是56.8%、14.8%、0.2%、0，說明隨著宮頸病變的進展，HPV感染患者清除病毒的能力顯著降低。李洪林等[1]研究發現，正常宮頸組的HR-HPV感染率顯著低于CINⅡ級、CINⅢ級及宮頸癌組，與CINⅠ組無明顯差異，其認為HR-HPV感染多存在于高級別上皮內瘤變及癌變組織中，是促進宮頸癌前病變向癌變發展的重要因素。本實驗發現SCC中的HRHPV感染率顯著高于NC組、LSIL組及HSIL組，LSIL組與NC組之間無明顯差異，提示LSIL病變之前的病毒感染是可逆的，當病毒的DNA整合入宿主基因組時，會導致持續感染，從而促進宮頸病變惡化。

3.2P-JAK2、P-STAT3及突變型p53與宮頸病變的關系JAK-STAT是一條由細胞因子刺激的信號轉導通路，參與細胞增殖、分化、凋亡以及免疫調節等許多重要的生物學過程，JAK2及STAT3是這條通路上重要的成員[2,7]。JAK2激活后，酪氨酸殘基磷酸化，招募含有SH2結構域的STAT3蛋白，STAT3 在Y705、Ser727、Lys685位點磷酸化，進一步入核調控下游靶基因表達，參與細胞凋亡、增殖、血管形成等過程，這在多種腫瘤研究中已經得到證實[2，8-10]。Xu等[11]通過系統分析發現非小細胞型肺癌中PSTAT3表達與肺癌分期、分化、淋巴轉移及預后有關。Shukla等[12]發現宮頸癌中持續激活的STAT3表達明顯高于癌前病變，與宮頸癌的不良預后有關。Sobti等[13]發現，宮頸癌組織中的STAT3 mRNA表達顯著高于正常宮頸組織及癌前病變組織，且癌組織中的STAT3 mRNA表達與臨床分期有關，其認為持續激活的STAT3可能通過調控Bcl-xL、Mcl-l、Bcl-2、Myc及細胞周期蛋白D1促進細胞惡性增殖，參與腫瘤進展。本研究結果顯示，P-JAK2在SCC中的陽性表達率顯著高于SIL組及NC組，且LSIL組及HSIL組均顯著高于NC組，表明P-JAK2表達發生于宮頸病變早期。SCC中的P-STAT3陽性表達率明顯高于LSIL組及NC組，SCC組與HSIL組無明顯差異，表明與P-JAK2相比，P-STAT3發揮作用較晚，可能主要發生于宮頸高級別病變時期。大量研究證實HPV病毒編碼的早期癌蛋白E6/E7是病毒感染導致宮頸癌變的重要因素，兩者分別抑制抑癌基因p53及Rb基因表達。突變型p53基因在多種惡性腫瘤中異常表達，可促使細胞惡性增殖[14]。本實驗發現突變型p53蛋白在SCC組中的陽性表達率顯著高于LSIL組及NC組，P-JAK2/P-STAT3及突變型p53表達在FIGO晚期（Ⅲ～Ⅳ）及伴有HRHPV感染的SCC組織中的陽性表達率高于FIGO早期（Ⅰ～Ⅱ）及病毒感染陰性的SCC組織，提示PJAK2/P-STAT3及突變型p53可能促進宮頸病變的進展。

3.3P-JAK2/P-STAT3、突變型p53與HR-HPV的關系JAK2磷酸化后，作用于STAT3，已在多種腫瘤中證實。Shukla等[12]發現P-STAT3蛋白表達與HPV感染有關，在HPV+細胞系中，P-STAT3表達顯著高于HPV-細胞系，認為STAT3表達及磷酸化可能與HPV感染形成及持續感染有關。Shukla等[4]研究發現，STAT3與HPV E6癌基因表達呈正相關，與野生型p53表達呈負相關，他們利用siRNA或AG490（阻滯STAT3的酪氨酸磷酸化）測得野生型p53的表達呈現劑量依賴性增加、E6表達下降、癌細胞生存能力下降，這在HPV感染的細胞系中表現尤為明顯，認為STAT3可以促進HPV病毒的致癌基因表達，促進病毒導致的宮頸病變進展，因此，抑制STAT3活化可能成為靶向治療宮頸癌的新方法。Niu等[10]在乳腺癌研究中得知，STAT3可抑制野生型p53表達，兩者表達呈負相關，然而突變后的p53失去STAT3的抑制位點，突變型p53可促進STAT3對細胞的惡性增殖作用。本研究顯示，隨著宮頸病變進展，P-JAK2、P-STAT3及突變型p53表達，HR-HPV感染率上調，且兩兩之間的陽性表達呈正相關，說明這四者在宮頸鱗癌形成、進展中可能有直接或間接的協同作用，檢測這4種因子可增加宮頸鱗癌診斷的準確性，可作為判斷宮頸鱗癌預后的指標。

參考文獻

[1] Li HL, Yin LR, Sun JJ. Association between HTERT gene amplifica?tion and high-risk HPV infection in cervical lesions[J]. Tianjin Med J, 2014, 42(2): 127-130. [李洪林，尹利榮，孫俊杰.宮頸病變中hTERT基因擴增與高危型HPV感染的關系[J].天津醫藥，2014, 42（2）：127-130].doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2014.02.009.

[2] Yang N, Han F, Cui H,et al. Matrine suppresses proliferation and in? duces apoptosis in human cholangiocarcinoma cells through sup?pression of JAK2/STAT3 signaling[J]. Pharmacol Rep,2015,67(2): 388-393. doi: 10.1016/j.pharep.2014.10.016.

[3] Alexandrova EM, Marchenko ND. Mutant p53-heat shock response oncogenic cooperation: a new mechanism of cancer cell survival[J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2015, 6:53. doi:10.3389/fendo.2015. 00053.

[4] Shukla S, Mahata S, Shishodia G, et al.Functional Regulatory Role of STAT3 in HPV16-Mediated Cervical Carcinogenesis [J]. PLoS One，2013, 8(7): e67849. doi: 10.1371/journal.pone.0067849.

[5] Goodman A. HPV testing as a screen for cervical cancer[J]. BMJ, 2015,350:h2372.doi:10.1136/bmj.h2372.

[6] An HJ, Sung JM, Park AR, et al. Prospective evaluation of longitudi?nal changes in human papillomavirus genotype and phylogenetic clade associated with cervical disease progression[J]. Gynecol On?col, 2011, 120(2):284 -290.

[7] Lee TL, Yeh J, Van Waes C, et al.Epigenetic modification of SOCS-1 differentially regulates STAT3 activation in response to interleu?kin- 6 receptor and epidermal growth factor receptor signaling through JAK and/or MEK in head and neck squamous cell carcino?mas[J]. Mol Cancer Ther, 2006, 5（1）: 8-19.

[8] Germain D, Frank DA. Targeting the cytoplasmic and nuclear func?tions of signal transducers and activators of transcription 3 for can?cer therapy[J]. Clin Cancer Res,2007,13(19):5665-5669.

[9] Li G, Xu J, Wang Z, et al. Low expression of SOCS1 and SOCS3 is a poor prognostic indicator for gastric cancer patients[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2014, 141 (3):443-452. doi: 10.1007/s00432-014-1838-5.

[10] Niu G,Wright KL, Ma Y, et al. Role of Stat3 in regulating p53 ex?pression and function[J]. Mol Cell Biol, 2005,25(17):7432-7440.

[11] Xu YH, Lu S. A meta-analysis of STAT3 and phospho-STAT3 ex?pression and survival of patients with non-small-cell lung cancer[J]. Eur J Surg Oncol, 2014, 40(3):311- 317. doi: 10.1016/j.ejso. 2013.11.012.

[12] Shukla S, Shishodia G, Mahata S, et al. Aberrant expression and constitutive activation of STAT3 in cervical carcinogenesis: implica?tions in high-risk human papillomavirus infection[J]. Mol Cancer, 2010, 27(9):282. doi: 10.1186/1476–4598-9-282.

[13] Sobti RC, Singh N, Hussain S, et al. Overexpression of STAT3 in HPV-mediated cervical cancer in a North Indian population[J]. Mol Cell Biochem,2009,330:193- 199. doi:10.1007/s11010- 009- 013 3-2.

[14] Kim CH,Lee HS,Park JH,et al.Prognostic role of p53 and Ki-67 im?munohistochemical expression in patients with surgically resected lung adenocarcinoma: a retrospective study[J]. J Thorac Dis, 2015,7 (5): 822-833. doi: 10. 3978 / j.issn. 2072-1439.

（2015-08-03收稿2015-09-23修回）

（本文編輯閆娟）

作者單位：天津醫科大學第二醫院婦科（郵編300211）

Expression and clinicopathological significance of P-JAK2, P-STAT3 and mutant p53 proteins in cervical lesions

MA Hui1，YIN Lirong1△，WANG Fang2，LI Honglin2，SHAN Shu2
Department of Gynecology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China
△CorrespondingAuthor E-mail:yinlirongfk@sina.com

Abstract:Objective To investigate the expression and prognostic significance of P-JAK2, P-STAT3 and mutant p53 in cervical lesions. Methods A total of 153 cervical biopsies of patients from Gynecology Department, The Second Hospital of Tianjin Medical University were recruited during December 2013 to June 2015. Fifty-seven cases of squamous carcinoma of cervix (SCC), 36 cases of low grade intraepithelial neoplasia (LSIL), 30 patients with high grade intraepithelial neoplasia (HSIL) and 30 cases of normal cervix (NC) were included in the study. Gene chip method was used to detect high-risk hu?man papillpmavirus（HR-HPV）infection. Hematoxylin-eosin staining was used to make pathological diagnosis. Immunohis?tochemical assay was used for the detection of P-JAK2, P-STAT3 and mutant type p53 protein expression in cervical le?sions. Results (1) HR-HPV infection rate and P-JAK2 expression were significantly higher in SCC group than those of HSIL group, LSIL group and NC group (P < 0.05). (2) The expression of P-STAT3 and mutant type p53 were significantly higher in SCC group than those of LSIL group and NC group (P＜0.05). However, there was no significant difference between SCC group and HSIL group. (3) The positive expressions of P-JAK2 and P-STAT3 showed significant differences in different FIGO stages, histopathological grade, lymph node metastasis and HR-HPV infection in SCC group, respectively (P < 0.05). There were significant differences in the positive expression of mutant type p53 between different FIGO stages and HR-HPV infection (P＜0.05). (4) There was positive correlation between P-JAK2, P-STAT3, positive expression of mutant type p53 and HR-HPV infection in SCC tissues (P＜0.05). There was a positive correlation between P-STAT3, p53 expression and HR-HPV infection (P < 0.05). There was a positive correlation between mutant p53 expression and HR-HPV infection (P < 0.05). Conclusion P-JAK2, P-STAT3 and mutant p53 protein expression rates are high in SCC group than those of NC and SIL groups, which may be associated with HR-HPV infection, cervical cancer occurrence and progression.

Key words：phosphorylated Janus kinase 2; phosphorylated signal transduction and transcription factor 3; mutant p53; squamous carcinoma of the cervix; high-risk human papillpmavirus; squamous intraepithelial lesion；immunohistochemistry

中圖分類號：R711.74

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/20150047

作者簡介：馬慧（1989），女，碩士研究生在讀，主要專注宮頸癌發病機制研究