生姜醇提取物對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后細胞凋亡和炎癥反應的影響

姜衛星

(冀中能源峰峰集團有限公司總醫院，河北 邯鄲 056200)

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生姜醇提取物對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后細胞凋亡和炎癥反應的影響

姜衛星

(冀中能源峰峰集團有限公司總醫院，河北 邯鄲 056200)

[摘要]目的觀察生姜醇提取物對肝臟缺血再灌注大鼠炎癥反應和肝細胞凋亡的影響。方法將84只SD大鼠隨機分為假手術組，模型組，生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg預處理組和金納多4 mg/kg預處理組，每組14只。自術前2周開始，各給藥組均灌胃給予相應藥物，假手術組和模型組灌胃生理鹽水，均每天1次。末次灌胃后第2天，除假手術組外，其余組均通過夾閉肝門靜脈和肝動脈的方法制備肝臟缺血再灌注模型，再灌注2 h后，測定血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)水平及炎癥因子C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10水平， HE染色觀察肝臟組織病理性形態，TUNEL染色觀察肝細胞凋亡情況并計算凋亡指數，檢測肝臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量，Western blot法檢測肝組織中NF-κB蛋白表達并進行半定量分析。結果與模型組比較，生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg預處理組大鼠血清ALT、AST、ALP及CRP、TNF-α、IL-6水平均明顯降低(P均<0.05)，其中400 mg/kg預處理組IL-1β水平顯著降低而IL-10水平顯著升高(P均<0.05)。生姜醇提取物各預處理組大鼠肝臟組織病變和肝細胞凋亡狀況呈不同程度改善，其中以400 mg/kg預處理組效果最為顯著；肝臟組織中SOD、CAT活性顯著升高而MDA含量顯著降低(P均<0.05)，肝細胞凋亡指數和NF-κB蛋白表達量均顯著降低(P均<0.05)。結論生姜醇提取物對大鼠肝臟缺血再灌注后細胞凋亡和炎癥反應具有抑制作用；作用機制可能與生姜醇提取物能夠有效改善抗氧化酶活性、降低氧化應激損傷、下調NF-κB蛋白表達有關。

[關鍵詞]生姜醇提取物；肝臟；缺血再灌注；炎癥；凋亡

肝臟手術過程中經常需要暫時阻斷血流以減少出血，但恢復血流再灌注后往往引發肝臟組織的進一步損傷[1]，即缺血再灌注損傷。近年來研究發現炎癥反應和細胞凋亡是缺血再灌注損傷的重要病理基礎[2]，為臨床上防治缺血再灌注損傷提供了新的思路。生姜性味辛溫，具有解表散寒、溫中止嘔、行水解毒之功效，為我國常用的傳統中藥之一。近年來研究發現，生姜具有抗凋亡和抑制炎癥反應的生物學活性[3]。本實驗通過采用夾閉肝門靜脈和肝動脈后松夾的方法成功制備肝臟缺血再灌注大鼠模型，研究了生姜醇提取物對肝臟缺血再灌注大鼠炎癥反應和肝細胞凋亡的影響，現將研究結果報道如下。

1實驗資料

1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠84只，體質量220～260 g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003。

1.2藥物與試劑生姜醇提取物(陜西旭煌植物科技有限公司，批號：140728，純度≥90%)；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10酶聯免疫(ELISA)檢測試劑盒購自美國密理博公司；谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；TUNEL染色試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司；NF-kB單克隆抗體購自南京建成生物工程研究所。

1.3主要儀器UV1800 紫外可見光分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；BS200生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；WD-2102A型全自動酶標儀(北京六一生物科技有限公司)；CUT4062型石蠟切片機(德國SLEE公司)；DYY-11 型多用電泳儀、JY-SCZ2電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.4方法

1.4.1動物分組與模型制備將84只SD大鼠隨機分為假手術組，模型組，生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg預處理組和金納多4 mg/kg預處理組，每組14只。自術前2周開始，生姜醇提取物100 ng/kg、200 mg/kg、400 mg/kg預處理組及金鈉多4 mg/kg預處理組均灌胃給予相應藥物，假手術組和模型組灌胃等體積生理鹽水，均每天1次。末次灌胃后第2天，除假手術組外，其余組均通過夾閉肝門靜脈和肝動脈的方法[4]制備肝臟缺血再灌注模型，假手術組行手術通路，但不阻斷肝門靜脈和肝動脈。缺血1 h再灌注2 h后，經腹主動脈取血，并取肝臟組織標本，-20 ℃保存待測。

1.4.2血清ALT、AST、ALP水平檢測各組大鼠取血液標本，經2 000 r/min離心5 min后取上層血清，根據試劑盒操作說明，通過全自動生化檢測儀測定各組大鼠血清ALT、AST、ALP水平。

1.4.3血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平測定取血液標本，置于冰上緩慢解凍后，根據ELISA試劑盒操作說明，通過全自動酶標儀測定各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平。

1.4.4肝臟組織病理形態學觀察取肝臟組織標本，置于4%多聚甲醛固定液中進行固定，經石蠟包埋、切片(厚度約5 μm)和展片處理后，行常規HE染色，于倒置光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理形態學改變。

1.4.5肝細胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數的計算取1.4.4步驟制備的肝臟組織石蠟切片，進行TUNEL染色，然后在光學顯微鏡下觀察肝細胞凋亡狀況(黃褐色細胞為陽性著色細胞)。每張染色切片隨機選取6個視野，分別計數每個視野中細胞總數和陽性著色細胞數，各組分別取平均值，然后計算肝細胞凋亡指數：凋亡指數(%)=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.4.6肝臟組織中SOD、CAT活性和MDA含量檢測每組隨機取7只大鼠的肝臟組織，研磨勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上清液，嚴格按照試劑盒操作步驟測定各組大鼠肝臟組織中SOD、CAT活性和MDA含量。

1.4.7肝臟組織NF-κB蛋白表達的檢測及半定量分析取1.4.6步驟每組剩余大鼠的肝組織勻漿上清液，采用BCA法進行蛋白定量，變性后上樣、電泳，待溴酚藍接近膠底部時停止、轉膜、春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(NF-κB，β-actin)4 ℃過夜；洗膜，二抗室溫搖床上孵育1 h后經ECL顯色，實驗結果應用Quantity One軟件進行分析。

2結果

2.1各組大鼠血清ALT、AST、ALP水平比較模型組大鼠血清ALT、AST、ALP水平均明顯高于假手術組(P均<0.05)；生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg預處理組和金納多4 mg/kg預處理組血清ALT、AST、ALP水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平比較模型組大鼠血清中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯高于假手術組(P均<0.05)， IL-10水平明顯低于假手術組(P<0.05)；生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg預處理組血清CRP、TNF-α、IL-6水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，其中400 mg/kg預處理組IL-1β水平明顯低于模型組(P<0.05)，IL-10水平明顯高于模型組(P<0.05)。見表2。

表1　各組大鼠血清ALT、AST、ALP水平比較

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠肝臟組織結構形態學表現假手術組大鼠肝臟組織結構及肝細胞形態均未見異常；模型組大鼠肝組織紋理不清，肝竇充血，部分肝小葉結構模糊，肝細胞呈空泡變性和壞死，胞核固縮并深染；而各給藥組肝臟組織病理形態學改變明顯改善，其中以生姜醇提取物400 mg/kg預處理組效果最為顯著。見圖1～6。

表2　各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平比較

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

圖1　假手術組大鼠肝臟組織病理形態學表現

圖2　模型組大鼠肝臟組織病理形態學表現

2.4各組大鼠肝臟組織TUNEL染色表現模型組大鼠肝細胞凋亡數量較假手術組明顯增多；而各給藥組大鼠肝細胞凋亡狀況明顯改善，其中以生姜醇提取物400 mg/kg預處理組效果最為顯著，見圖7～12。假手術組大鼠肝細胞凋亡指數為(2.6±1.4)%，模型組為(37.5±6.9)%，生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg預處理組分別為(30.2±7.0)%、(24.1±5.4)%、(14.7±4.2)%，金納多4 mg/kg預處理組為(26.9±5.5)%。模型組大鼠肝細胞凋亡指數明顯高于假手術組(P<0.05)，而生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg預處理組和金納多4 mg/kg預處理組均明顯低于模型組(P均<0.05)。

圖4　生姜醇提取物200 mg/kg預處理組大鼠肝臟

圖5　生姜醇提取物400 mg/kg預處理組大鼠肝臟

圖6　金納多4 mg/kg預處理組大鼠肝臟組織病理形態學表現

圖7　假手術組大鼠肝細胞凋亡表現

圖8　模型組大鼠肝細胞凋亡表現

圖9　生姜醇提取物100 mg/kg預處理組大鼠肝細胞凋亡表現

圖10　生姜醇提取物200 mg/kg預處理組大鼠肝細胞凋亡表現

圖11　生姜醇提取物400 mg/kg預處理組大鼠肝細胞凋亡表現

圖12　金納多4 mg/kg預處理組大鼠肝細胞凋亡表現

2.5各組大鼠肝臟組織中SOD、CAT活性和MDA含量比較模型組大鼠肝臟組織中SOD、CAT活性明顯低于假手術組(P均<0.05)，MDA含量明顯高于假手術組(P<0.05)；生姜醇提取物200mg/kg、400 mg/kg預處理組SOD、CAT活性均明顯高于模型組(P均<0.05)，MDA含量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表3。

2.6各組大鼠肝臟組織NF-κB蛋白表達量比較假手術組、模型組、生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg預處理組和金納多4mg/kg預處理組肝臟組織NF-κB蛋白相對表達量分別為0.15±0.04，0.42±0.13，0.37±0.12，0.32±0.09，0.26±0.08，0.30±0.10。模型組大鼠肝臟組織中NF-κB蛋白相對表達量明顯高于假手術組(P<0.05)，而生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg預處理組和金納多4 mg/kg預處理組的NF-κB蛋白表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)。各組大鼠肝臟組織中NF-κB蛋白表達量電泳圖見圖13。

表3　各組大鼠肝臟組織中SOD、CAT活性和MDA含量比較±s)

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

A為假手術組；B為模型組；C為生姜醇提取物100 mg/kg預處理組；

3討論

肝臟缺血再灌注損傷是影響肝臟手術預后、損傷肝功能的危險因素之一。近年來，隨著病理生理機制研究的深入，發現炎癥反應及其繼發的細胞凋亡是其重要的發病原因之一。華晨等[5]和齊艷艷等[6]研究發現，通過抑制炎癥反應、改善肝細胞凋亡能夠有效緩解肝臟缺血再灌注損傷。

肝臟組織中脂質過氧化終產物MDA含量能夠間接反映肝細胞膜受氧化應激損傷程度[7]； SOD能夠提供氫原子配體而催化還原氧自由基生成過氧化氫[8-9]，并在CAT的作用下進一步還原生成對人體無害的水和氧[10]，因此SOD和CAT的活性能夠反映機體抗氧化能力水平。血清中ALT、AST和ALP水平是反映肝功能及肝細胞損傷程度的重要指標，正常情況下，血液中ALT、AST含量都非常低，當細胞膜系統受氧自由基攻擊而受損時，它們將迅速釋放入血，使血清中含量陡然增高，因此血清中三者的水平能夠非常敏感地反映肝臟組織受損傷程度，而血清中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平是臨床上用來監測體內炎癥反應的常用指標。

細胞凋亡是一種有多種基因參與調控的程序化死亡過程，可由多種因素導致其發生，其中氧化應激損傷是其重要的誘發因素[11]。NF-κB為多效能核轉錄因子，常態下，NF-κB以無活性形式存在于胞質中；而當細胞受到外界因素刺激時，NF-κB將暴露出核定位信號并進入胞核內，調控靶基因的轉錄與表達。Zhang等[12]研究發現，NF-κB激活能夠對抗氧化應激誘導的心肌細胞凋亡，證實NF-κB激活與氧化應激誘導的心肌細胞凋亡密切相關。

生姜為姜科植物姜的新鮮根莖，現代藥理學研究發現，其提取物具有良好的抗氧化活性。本研究發現生姜醇提取物能夠有效降低血清中炎癥因子水平，改善抗氧化酶活性，抑制氧化應激損傷，改善肝臟組織病變，降低NF-κB蛋白表達水平，抑制肝細胞凋亡，提示生姜醇提取物對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后肝臟細胞亡凋和炎癥反應具有抑制作用。

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Effect of ethanol extract of zingiber officinale against inflammation and hepatocyte apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion injury in rats

JIANG Weixing

(Jizhong Energy Fengfeng Group Hospital, Handan 056200, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of ethanol extract of zingiber officinale against inflammation and hepatocyte apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion injury in rats. Methods 84 SD rats were randomly divided into five groups: sham operation group, ischemia-reperfusion control group, ethanol extract of zingiber officinale (100, 200, 400 mg/kg) dose per-treated groups and Ginaton 4 mg/kg per-treated group, 14 cases in each group. Two weeks before operation, the animals were treated with corresponding drug or normal saline by intragastric administration, once a day. Second days after the last irrigation stomach, except the sham operation group, the hepatic ischemia reperfusion models in the other groups were made by occlusion of hepatic portal vein and hepatic artery. Two hours after reperfusion, the content of ALT, AST, ALP, CRP, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 in plasma were detected, the histopathological changes were observed by HE staining, the activity of SOD, CAT and the content of MDA were determined; the hepatocyte apoptosis were observed by TUNEL staining, and the apoptosis (AI) was calculated; the expression of NF-κB protein was detected by Western blot and semi-quantitative analysis. Results Compared with the ischemia-reperfusion control group, the contents of CRP, TNF-α, IL-6 in plasma of ethanol extract of zingiber officinale 200, 400 mg/kg dose per-treated groups were significantly decreased (all P<0.05); the content of IL-1β was significantly decreased and the content of IL-10 was significantly increased in ethanol extract of zingiber officinale 100 mg/kg dose per-treated group (all P<0.05). The activity of SOD, CAT were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased in ethanol extract of zingiber officinale per-treated groups, the histopathological changes and the hepatocyte apoptosis were significantly improved, the AI and the expression of NF-κB proten were significantly down-regulated (all P<0.05). Conclusion The ethanol extract of zingiber officinale has inhibition effects against inflammation and hepatocyte apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion injury in rats; which perhaps relate to its effects of improve the activity of antioxidase, and reduce the damage of free radical, and down-regulate the expression of NF-κB proten.

Key words:ethanol extract of zingiber officinale; liver; ischemia-reperfusion; inflammation; apoptosis

[收稿日期]2015-10-30

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)09-0932-06

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.09.007

[作者簡介]姜衛星，男，主治醫師，從事普通外科臨床研究工作。