膝骨關節炎患者關節液中miR-140的表達及其臨床意義

韓朝永

(江蘇省南京市浦口區中醫院，江蘇 南京 211800)

?

膝骨關節炎患者關節液中miR-140的表達及其臨床意義

韓朝永

(江蘇省南京市浦口區中醫院，江蘇 南京 211800)

[摘要]目的探討miR-140在膝骨關節炎(KOA)患者關節液中的表達及臨床意義。方法選取60例KOA患者和20名健康對照者作為研究對象。采用實時熒光定量RT-PCR檢測KOA患者和健康對照者關節液中miR-140表達水平，分析關節液中miR-140表達水平與KOA的相關性。結果KOA患者關節液miR-140表達水平明顯低于健康對照者(P<0.05)。進一步研究發現患者關節液中miR-140水平與Kellgren-Lawrence 分級有顯著相關性(r=-0.742,P<0.05)。結論關節液miR-140的表達水平不僅可以作為KOA的早期診斷標志物，也可作為判斷KOA嚴重程度的參考指標。

[關鍵詞]膝骨關節炎；關節液；miR-140

膝關節骨性關節炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種常見于中老年人的慢性關節疾病，其病理改變主要表現為關節軟骨的退行性變和繼發性骨質增生。臨床上多表現為膝關節腫脹、疼痛、活動受限，嚴重者可導致關節畸形[1]。據流行病學統計數據顯示，60歲以上人群KOA患病率約為60%，75歲以上人群則高達80%，其致殘率可高達50%以上。不僅給個人帶來嚴重的痛苦，也給家庭和社會造成沉重的負擔[2-3]。因此，如何有效地預防和治療KOA已成為重大的公共衛生學問題。KOA病因復雜，多種致病因素和因子均會導致KOA的發生和發展。microRNA(miRNA)是近年來發現的一類內源性單鏈小分子RNA，通過對靶基因轉錄后水平的調控來發揮其功能[4]。目前的研究證實miRNA參與調控一系列重要生理病理過程，包括在免疫炎癥反應以及骨關節炎發病中也發揮著重要的調節作用。新近的研究發現，miR-140與關節炎發生密切相關[5-6]。本研究通過對膝關節液中miR-140表達水平的測定，探討其在KOA發病中的作用，為KOA的診斷和治療提供依據。

1臨床資料

1.1一般資料選擇2014年1月—2015年6月在我院接受治療的60例KOA患者和20名健康對照者作為研究對象。60例KOA患者中男17例，女43例；年齡53～78(57.74±4.92)歲；病程1～8(3.47±1.52)年。所有患者均符合美國風濕病學會推薦的KOA診斷標準：①膝關節痛在就診的前1個月內≥14 d；②膝關節活動時有骨磨擦音；③X射線示膝關節骨端邊緣有骨刺增生或骨贅形成；④膝關節骨性腫脹；⑤膝關節晨僵≤30 min；⑥年齡≥40歲。符合上述條件中的①③或①②④⑤⑥即可診斷為KOA。采用Kellgren-Lawrence(K-L)[7]分級評估KOA臨床病情：其中Ⅱ級20例，Ⅲ級24例，Ⅳ級16例。排除標準：①有感染性關節炎，膝關節創傷及手術史，糖尿病患者；②類風濕關節炎等自身免疫性疾病的患者；③檢查前2周使用過糖皮質激素或非甾體類抗炎藥的患者；④其他反應性關節炎等關節疾病的患者。本研究經過醫院倫理委員會批準，每位受試者均簽署知情同意書。

1.2關節液的收集與保存受試者取平臥位，膝關節局部消毒麻醉后，取髕上外側入路行膝關節腔穿刺，抽取關節液約2 mL，室溫下靜置1 h。然后3 000 r/min離心20 min去除細胞和關節組織殘存碎片，取上清置于新1.5 mL微量離心管，-80 ℃冰箱保存待后續檢測。

1.3miR-140檢測①總RNA的提取：Trizol法提取關節液總RNA。變性瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測法檢測RNA質量和濃度。②miRNA逆轉錄：制備20 μL RT混合反應液：Total RNA 0.3 μg，dNTP (2.5 mM each)2 μL，RT特異引物(1 μM)0.5 μL，MMLV反轉錄酶(10 IU/μL)2 μL，RNA酶抑制劑(40 IU/μL) 0.3 μL，10×RT Buffer 2 μL。RT反應條件：16 ℃，30 min；42 ℃，40 min；85 ℃，5 min；反應結束后，冰上冷卻5 min，-80 ℃保存。③Realtime PCR反應：采用8 μL的反應體系：dNTP(2.5 mM each)1.0 μL，10×PCR緩沖液1.0 μL，MgCl2溶液0.6 μL，Taq聚合酶0.5 IU，Sybergreen I至終濃度0.25×，10 μM的PCR特異引物F 0.4 μL，10 μM的PCR特異引物R 0.4 μL，2×ROX Reference Dye 0.2 μL。反應條件如下：95 ℃，3 min；40個PCR循環(95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 s)，實驗重復3次。以U6 snRNA作為內參，數據采用2-ΔΔCT法進行分析。miR-140上游引物5’-GCCTCAGTGGTTTTACCCTA-3’,下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT -3’。

2結果

2.1KOA患者與健康人關節液miR-140表達比較RT-PCR結果顯示：健康對照者關節液miR-140相對表達水平為1.04±0.29，KOA患者關節液miR-140表達水平為0.51±0.24，KOA患者明顯低于健康對照者(P<0.05)，見圖1。

圖1　不同分組患者關節液miR-140水平

2.2不同嚴重程度KOA患者關節液miR-140表達比較不同K-L分級患者中，Ⅱ級患者關節液miR-140相對表達水平為0.69±0.30，Ⅲ級患者關節液miR-140表達為0.51±0.24，Ⅳ級患者關節液miR-140表達為0.36±0.21；K-LⅣ級患者關節液miR-140表達明顯高于Ⅱ級和Ⅲ級患者(P<0.05)，見圖1。

2.3KOA患者關節液miR-140表達與K-L分級的相關性Spearman秩相關分析結果顯示：miR-140在關節液中的表達水平與KOA的K-L分級呈顯著負相關性(r=-0.742,P<0.05)，見圖2。

圖2　關節液miR-140水平與KL分級的相關性散點圖

3討論

KOA的發病機制十分復雜，目前尚未完全闡明，可能為關節生物力學性質的改變、關節創傷、機體免疫反應、細胞因子、性激素水平等因素綜合作用所致[8]。隨著對miRNA研究的不斷深入，目前已有大量文獻報道miRNA與KOA的發生、發展存在密切關系。Iliopoulos等[9]對比檢測發現，KOA患者和正常健康者軟骨組織間存在16個差異表達的miRNAs，提示這些miRNAs可以用來區分KOA細胞和正常的軟骨細胞。目前的研究已經證實，KOA的發病與軟骨細胞和基質中異常活化的炎癥遞質和基質降解酶密切相關。Yamasaki等[10]研究發現，隨著骨關節炎軟骨退行性病變的加重，軟骨中miR-146a的表達量逐漸減少，而基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)則呈平行上升趨勢。特別是經IL-1β體外刺激可以導致軟骨細胞miR-146a表達明顯升高。提示miR-146a可能通過調控IL-1β和MMP-13來參與調控KOA的發病。由于miRNA與靶基因的mRNA的3’-UTR不完全互補結合，因此miRNA具有調控多個靶基因的能力。因此miRNA在KOA發病機制中起的重要作用也逐步受到學者們的認可和重視。

miR-140為軟骨細胞中特異性高表達的miRNA，不僅參與調控人類軟骨形成和發育，同時在維持軟骨細胞平衡方面起著重要作用[11]。動物研究發現，敲除miR-140可導致的小鼠軟骨內成骨的生長缺陷，關節軟骨細胞發生凋亡[12]。尤為重要的是小鼠出現了與骨性關節炎的病理改變，而轉基因過表達miR-140則可以抵制抗原誘導的關節炎的出現。進一步研究發現，其可能機制在于miR-140能直接抑制Adamts-5這一導致骨關節炎關節軟骨基質降解的重要水解酶的表達。而骨關節炎病程中由于某種因素導致miR-140表達失調引起Adamts-5正常調控機制的失衡，從而導致骨關節炎的發生。

隨著高靈敏性基因芯片和PCR技術的使用，目前在人體液(如血液、關節液、腹腔液、精液等)中能夠檢測到穩定表達的miRNAs，且其表達譜和表達水平的異常改變與多種疾病病變情況密切相關。目前已經證實KOA患者關節液中相關細胞因子和蛋白酶表達水平會發生改變，且這種改變與軟骨損傷程度和疾病的嚴重程度有關[13]。本研究采用RT-PCR檢測KOA患者關節液中miR-140表達改變情況。結果顯示：KOA患者關節液中miR-140表達水平明顯低于健康人，提示關節液miR-140的低表達不僅可以作為早期診斷KOA的生化指標，且miR-140的缺失可能是導致KOA發生發展的重要因素，這與相關報道是一致的[14]。由于關節液由關節面滑膜分泌產生，因此，根據以往文獻報道認為關節液中的miR-140主要來源于關節軟骨和滑膜組織的分泌和滲透[15]。由于KOA患者關節軟骨和滑膜組織的miR-140表達明顯降低，因而導致關節液中miR-140表達水平也相應降低。進一步采用Kellgren-Lawrence對60例KOA患者嚴重程度進行分級，結果顯示：隨著骨關節炎疾病的進展，KOA患者關節液中miR-140表達也依次降低。即KOA患者關節液中miR-140表達水平與骨關節炎嚴重程度呈負相關。這表明關節液中miR-140表達水平還可以作為評價膝骨關節炎影像和病變嚴重進展的生化指標。

總之，本次研究結果結合國內外相關報道，證明miR-140與KOA的發生發展密切相關。深入研究miR-140不僅有助于進一步闡明KOA的發病機制，關節液miR-140的表達也可以為KOA的診斷和病情評估提供重要參考依據。此外，通過將miR-140作為KOA干預治療的靶點，從基因組學和轉錄調控機制上為KOA的治療提供一種新的手段。

[參考文獻]

[1]Ikeuchi M,Izumi M,Aso K,et al. Clinical characteristics of pain originating from intra-articular structures of the knee joint in patients with medial knee osteoarthritis[J]. Springerplus,2013,2:628

[2]Bennell K,Dobson F. Review: Exercise interventions improve pain and function in people with knee osteoarthritis compared with no exercise[J]. Evid Based Nurs,2014,17(4):109

[3]Khan AA,Jahangir U,Urooj S. Management of knee osteoarthritis with cupping therapy[J]. J Adv Pharm Technol Res,2013,4(4):217-223

[4]David R. Small RNAs:miRNA machinery disposal[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(1):4-5

[5]Araldi E,Schipani E. MicroRNA-140 and the silencing of osteoarthritis[J]. Genes Dev,2010,24(11):1075-1080

[6]Hwang S,Park SK,Lee HY,et al. miR-140-5p suppresses BMP2-mediated osteogenesis in undifferentiated human mesenchymal stem cells[J]. FEBS Lett,2014,588(17):2957-2963

[7]Spector TD,Cooper C. Radiographic assessment of osteoarthritis in population studies: whither Kellgren and Lawrence?[J]. Osteoarthritis Cartilage,1993,1(4):203-206

[8]Iqbal MN,Haidri FR,Motiani B,et al. Frequency of factors associated with knee osteoarthritis[J]. J Pak Med Assoc,2011,61(8):786-789

[9]Iliopoulos D,Malizos KN,Oikonomou P,et al. Integrative microRNA and proteomic approaches identify novel osteoarthritis genes and their collaborative metabolic and inflammatory networks[J]. PLoS One,2008,3(11):e3740

[10] Yamasaki K,Nakasa T,Miyaki S,et al. Expression of MicroRNA-146a in osteoarthritis cartilage[J]. Arthritis Rheum,2009,60(4):1035-1041

[11] Nicolas FE,Pais H,Schwach F,et al. Experimental identification of microRNA-140 targets by silencing and overexpressing miR-140[J]. RNA,2008,14(12):2513-2520

[12] Miyaki S,Sato T,Inoue A,et al. MicroRNA-140 plays dual roles in both cartilage development and homeostasis[J]. Genes Dev,2010,24(11):1173-1185

[13] Mabey T,Taleongpong P,Udomsinprasert W,et al. Plasma and synovial fluid autotaxin correlate with severity in knee osteoarthritis[J]. Clin Chim Acta,2015,444:72-77

[14] Zhang R,Ma J,Yao J. Molecular mechanisms of the cartilage-specific microRNA-140 in osteoarthritis[J]. Inflamm Res,2013,62(10):871-877

[15] 周新華，王敏，姬顏輝，等. miRNA-140在早期骨關節炎軟骨細胞中的表達規律及功能[J]. 第二軍醫大學學報,2014,35(6):610-615

[收稿日期]2015-12-31

[中圖分類號]R593.21

[文獻標識碼]B

[文章編號]1008-8849(2016)13-1422-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.018