STAT3在sRAGE抑制缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡中的作用

郭彩霞　江　雪　曾翔俊　陳步星*

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院心內科，北京 100050；2.首都醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，北京 100069)

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STAT3在sRAGE抑制缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡中的作用

郭彩霞1江雪1曾翔俊2陳步星1*

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院心內科，北京 100050；2.首都醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，北京 100069)

【摘要】目的 建立體內和體外缺血再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)模型，觀察缺血再灌注心肌細胞凋亡情況及STAT3蛋白表達變化；檢測sRAGE對缺血再灌注心肌細胞凋亡及STAT3的蛋白表達的影響。方法復制C57BL/6J小鼠心臟和原代心肌細胞缺血再灌注模型，在sRAGE和(或)STAT3抑制劑AG490的干預下，通過檢測TUNEL及caspase-3活性評價心肌細胞凋亡的程度；通過Western blotting檢測磷酸化的STAT3(p-STAT3)及總的STAT3(t-STAT3)蛋白的表達。結果體內實驗，與Sham組相比，I/R組TUNEL陽性細胞數目和caspase-3活性分別增加了115%和120%，I/R組p-STAT3/STAT3比值降低了50%，sRAGE降低了I/R誘導的心肌細胞凋亡，包括TUNEL陽性細胞數目降低了51%，caspase-3活性降低了36%，此外，sRAGE預處理I/R組的p-STAT3/STAT3比值增加了381%； 體外實驗，與Control組相比，I/R組TUNEL陽性細胞數目和caspase-3活性分別增加了380%和77%，I/R組p-STAT3/STAT3比值降低了69%，sRAGE(900 ng/mL) 同樣降低了I/R誘導的心肌細胞凋亡，表現為TUNEL陽性細胞數目降低了63%，caspase-3活性降低了33%，此外，sRAGE預處理I/R組的p-STAT3/STAT3比值增加了243%，與I/R+sRAGE組相比較，I/R+sRAGE+AG490組的TUNEL陽性細胞數目升高了126%，caspase-3活性增加了42%，p-STAT3/STAT3比值降低了68%。結論sRAGE可通過激活STAT3抑制缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡。

【關鍵詞】sRAGE；心肌缺血再灌注；凋亡；STAT3

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)是目前嚴重威脅人類健康的疾病之一，再灌注治療是目前最有效的治療手段，隨著冠狀動脈介入和搭橋等治療手段的飛速提高，患者預后明顯改善，但會引起致命的缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion，I/R)。心肌I/R 損傷是心肌I/R 后所致的心肌結構改變和功能障礙進一步加重的現象，表現為心肌收縮能力降低、再灌注性心律失常的發生、心肌能量代謝的減弱及心肌結構的破壞等[1-2]，嚴重降低了冠心病的救治及其預后。因此，進行干預挽救缺血心肌的同時，最大限度的減少與預防再灌注導致新的心肌細胞損傷、保護健存心肌是當前需要攻克的重大難關。

目前有一些預防及治療心肌I/R 損傷的干預措施，如提高心肌氧和能量供應、減輕心臟負擔和降低能量消耗等外源性方法；而抑制心肌I/R 損傷的內源性保護機制備受關注，其中包含缺血預處理和藥物預處理[3-4]，其中，藥物預處理的概念，即用藥物刺激或模擬機體內源性抗損傷方式，主要是通過影響內源性物質的釋放減輕術中及術后的心肌炎性反應、氧化應激等病理損傷而發揮保護作用。

sRAGE 是高級糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end-products，RAGE)的異構體，二者有共同的配基結合位點。sRAGE具有“誘餌”的作用，即可以結合RAGE的配體，但不會轉導細胞信號，從而起到阻斷AGEs-RAGE通路而發揮保護作用[5]。RAGE屬于免疫球蛋白超家族的細胞表面多配基信號轉導受體。RAGE分布廣泛，如心肌細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、單核巨噬細胞、周細胞、神經元等均可表達。

本課題組前期研究[6]已經發現，在大鼠缺血再灌注模型外周血中sRAGE明顯降低。外源性給予sRAGE可減少體外復制的缺氧/復氧模型心肌細胞線粒體通透性轉換孔mPTP的開放，使線粒體膜電位去極化程度減輕，提高缺氧/復氧心肌細胞的存活率[6]。本研究選擇復制動物心臟和心肌細胞缺血再灌注模型，進一步觀察sRAGE對缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡作用的具體機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑

DeadEndTM TUNEL熒光法檢測試劑盒購自美國的Promega公司；DAPI購自美國Sigma公司；caspase-3 活性檢測試劑盒購自美國的BioVision公司；蛋白定量BCA試劑盒、組織裂解液及脫脂奶粉均購自北京普利萊基因技術有限公司；sRAGE購自北京愛迪博生物科技有限公司；AG490及Tween-20購自美國Sigma公司；總的和磷酸化的STAT3抗體均購自美國Cell signaling Technology公司；羊抗鼠IgG抗體-辣根過氧化物酶標記購自美國Santa Cruz公司。

1.1.2動物

6～8周的雄性C57BL/6小鼠和新生(24 h以內)的SD大鼠乳鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.1.3儀器及設備

小動物心臟超聲儀器Vevo770(Visual Sonics公司，加拿大)；小動物麻醉機XGI-8(Caliper公司，美國)；CM1950石蠟切片機(Leica 公司，德國)；DIAX900勻漿儀(Heidolph公司，德國)；Olympus BX51熒光顯微鏡(奧林巴斯公司，美國)；超速低溫離心機(Sigma公司，美國)；電泳裝置、電轉移裝置及凝膠成像系統(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1在體小鼠心肌缺血再灌注模型的制備

實驗采用23～25g健康雄性C57BL/6小鼠，2%(體積分數)異氟烷吸入麻醉。開胸，胸骨左側2 mm切開皮膚，鈍性分離肌肉見肋骨，在第4肋間隙用眼科剪輕輕向下分離肋間肌，向上伸入血管鉗反復夾閉兩根肋骨以減少出血。用拉鉤拉開胸壁，暴露心臟，在左心耳下緣3～4 mm進針，進針深約1.5 mm，斜向右上方肺動脈圓錐方向出針，針距約3～4 mm，結扎和松開冠狀動脈左前降支，采用缺血30 min后再灌注24 h復制缺血/再灌注模型[7]。假手術組采取相同的手術方式，但是不結扎血管。術前12 h及術后12 h分別腹腔注射sRAGE，等體積的0.9%(質量分數)的氯化鈉注射液溶解藥物，100 μg/只[8]。再灌注24 h后進行心臟超聲檢測心功能。

實驗分組： Sham組：血管置線但不結扎(n=3)，術前和術后12 h分別腹腔注射等體積的0.9%(質量分數)的氯化鈉注射液；Sham+sRAGE組：術前和術后12 h分別腹腔注射sRAGE，100 μg/只，余處理同Sham組(n=3)。I/R組：結扎左前降支30 min，再灌注24 h，術前和術后12 h分別腹腔注射等體積的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液(n=3)。I/R+sRAGE組：術前和術后12 h分別腹腔注射sRAGE，100 μg/只，余處理同I/R組(n=3)。

1.2.2原代心肌細胞缺血再灌注模型的制備

正常培養原代心肌細胞72 h后，應用“缺血buffer”(pH 6.3)代替DMEM培養基刺激細胞復制缺血模型[9]，缺血buffer 包含以下物質: 118 mmol/L NaCl， 24 mmol/L NaHCO3， 1.0 mmol/L NaH2PO4， 2.5 mmol/L CaCl2·2H2O， 1.2 mmol/L MgCl2， 20 mmol/L 乳酸鈉， 16 mmol/L KCl 和 10 mmol/L脫氧葡萄糖。將缺血buffer加入實驗組的培養孔，2 mL/孔，然后將細胞放在37 ℃、5%(體積分數) CO2細胞培養箱中孵育，2 h后將缺血buffer換為無血清的DMEM培養基再持續灌注24 h。對于對照組，心肌細胞一直培養在無血清的DMEM培養基中。

實驗分組：(1)對照組(Control)： DMEM完全培養基培養心肌細胞；(2)Control+sRAGE(Control+sRAGE)組： DMEM完全培養基中加入sRAGE[6]，余處理同Control組；(3)Control+AG490(Control+AG490)組：DMEM完全培養基中加入AG490[10]，余處理同Control組； (4)缺血再灌注(I/R)組：缺血buffer替代DMEM完全培養基，使心肌細胞缺血2 h，后將缺血buffer更換為DMEM完全培養基，使心肌細胞再灌注24 h；(5)缺血再灌注+sRAGE(I/R+sRAGE)組：缺血前10 min DMEM完全培養基中加入sRAGE(900 nmol/L)，余處理同I/R組。(6)缺血再灌注+sRAGE+AG490(I/R+sRAGE+AG490)組：缺血前30 min和10 min DMEM完全培養基中分別加入AG490(5μmol/L)和sRAGE(900 ng/mL)，余處理同I/R組。

1.2.3心肌組織及心肌細胞的TUNEL及caspase-3活性檢測

石蠟包埋的心臟組織切成4～5 μm厚度，經過脫蠟入水、固定及通透等過程后，離體心肌細胞則經4%(質量分數)甲醛固定后，將樣品37 ℃避光孵育在rTdT緩沖液中1 h，清洗、固定，DAPI染核，固定、抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察、照相，以凋亡細胞核數占總細胞核數的百分比作為細胞凋亡率[11]。熒光法檢測caspase-3的活性，樣品在缺血buffer的作用下裂解，14 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，樣品上清液及熒光底物加入96孔板，0 min測定基礎值，37 ℃避光孵育1.5 h后再次讀取數值，熒光計的最佳波長為405 nm。同時BCA法測定各組織的蛋白濃度，2次讀取的數值之差除以各自的蛋白濃度即為caspase-3活性[12]。

1.2.4組織和細胞STAT3蛋白的表達檢測

心肌組織加入RIPA裂解液(20 mg加0.2 mL)，同時加入PMSF(1∶100)，勻漿器進行勻漿，冰上孵育30 min，4 ℃下12 500 r/min，離心15 min，上清液測蛋白濃度及蛋白定量。經SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜，室溫下5%(質量分數)脫脂牛奶封閉60 min，3%(質量分數)脫脂牛奶孵育總泛素蛋白一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜。TBST洗膜后，室溫孵育羊抗鼠IgG抗體-辣根過氧化物酶標記二抗60 min，凝膠成像系統成像[13]。

1.3統計學方法

2結果

2.1心肌組織中TUNEL及caspase-3活性的改變

Sham組與Sham+sRAGE組TUNEL陽性心肌細胞極少，兩組間細胞凋亡率差異無統計學意義[(4.5±0.4)%vs(2.9±0.3)%，P>0.05)]。與Sham組相比，I/R組細胞凋亡率明顯增加了115%[(36.3±1.5)%vs(2.9±0.3)%，P<0.05)]。與I/R組相比，I/R+sRAGE組細胞凋亡率明顯降低了51%[(17.8±0.7)%vs(36.3±1.5)%，P<0.05)](圖1A、B)。

Sham組與Sham+sRAGE組間caspase-3活性差異無統計學意義[(1.0±0.1)%vs(1.1±0.2)%，P>0.05)]。與Sham組相比，I/R組caspase-3活性明顯升高了120%[(2.2±0.5)%vs(1.0±0.1)%，P<0.05)]。與I/R組相比，I/R+sRAGE組caspase-3活性明顯從(2.2±0.5)%降低至(1.4±0.2)% (P<0.05) (圖1C)。

2.2組織STAT3的蛋白表達

與Sham組相比較，I/R組p-STAT3/STAT3比值降低了50% (0.17±0.11vs0.35±0.03，P<0.05)，差異有統計學意義；與I/R組相比較，sRAGE預處理I/R組的p-STAT3/STAT3比值增加了381% (0.84±0.16vs0.17±0.11，P<0.05)，差異有統計學意義。另外，與Sham組相比較，sRAGE預處理Sham組的p-STAT3/STAT3升高了85% (0.64±0.13vs0.35±0.03，P<0.05) (圖2)。

圖1　小鼠心肌細胞凋亡檢測

A：representative photomicrographs of TUNEL-stained myocardium sections from wild-type (WT) exposed to sham operation or ischemia-reperfusion (I/R). TUNEL-positive nuclei (green)， myoglobin (red)， and DAPI (blue); Scale bar: 50 μm. B：quantitative analysis of apoptosis;n=3-4 per group. C：myocardial cell apoptosis was determined by caspase-3 activity assay in sham， sham+ sRAGE and experimental mice 24 h after I/R injury from different groups; Values are expressed as means±SE.*P<0.05vssham group，#P<0.05vsI/R group； sRAGE:soluble receptor for advanced glycation end products； I/R:ischemia/reperfusion.

圖2　小鼠心肌凋亡相關蛋白表達

A：Western blotting analysis for p-STAT3 and t-STAT3. B：quantitative analysis of p-STAT3 to t-STAT3.n=3-4 per group. Values are expressed as means±SE.*P<0.05vssham group，#P<0.05vsI/R group； sRAGE:soluble receptor for advanced glycation end products； I/R:ischemia/reperfusion.

2.3 原代心肌細胞中TUNEL及caspase-3活性的改變

Control組與Control+sRAGE組間細胞凋亡率差異無統計學意義[(1.1±0.2)%vs(1.0±0.1)%，P>0.05)]，Control組與Control+AG490組間細胞凋亡率差異無統計學意義[(1.1±0.3)%vs(1.0±0.1)%，P>0.05)]；與Control組相比，I/R組細胞凋亡率明顯增加[(3.8±0.9)%vs(1.0±0.1)%，P<0.05)]；與I/R組相比，I/R+sRAGE組細胞凋亡率明顯降低[(1.4±0.6)%vs(3.8±0.9)%，P<0.05)]；與I/R+sRAGE組相比較，I/R+sRAGE+AG490組細胞凋亡率明顯升高[(3.2±0.7)%vs(1.4±0.6)%，P<0.05)](圖3A、B)。

Control組與Control+sRAGE組間caspase-3活性差異無統計學意義[(0.9±0.1)%vs(1.0±0.1)%，P>0.05)]；Control組與Control+AG490組間caspase-3活性差異無統計學意義[(1.0±0.3)%vs(1.0±0.1)%，P>0.05)]；與Control組相比，I/R組caspase-3活性明顯升高了77%[(1.8±0.5)%vs(1.0±0.1)%，P<0.05)]；與I/R組相比，I/R+sRAGE組caspase-3活性明顯從(1.8±0.5)%降低至(1.2±0.4)% (P<0.05)；與I/R+sRAGE組相比，I/R+sRAGE+AG490組caspase-3活性從(1.2±0.4)%升高至(1.7±0.3)% (P<0.05) (圖3C)。

2.4原代心肌細胞中STAT3的蛋白表達

與Control組相比較，I/R組p-STAT3/STAT3比值降低了69% (0.18±0.09vs0.60±0.05，P<0.05)，差異有統計學意義；與I/R組相比較，sRAGE預處理I/R組的p-STAT3/STAT3比值增加了243% (0.63±0.14vs0.18±0.09，P<0.05)，差異有統計學意義；與I/R+sRAGE組相比較，I/R+sRAGE+AG490組p-STAT3/STAT3比值降低了68% (0.20±0.11vs0.63±0.14，P<0.05)。另外，與Control組相比較，sRAGE預處理Sham組的p-STAT3/STAT3升高了20% (0.72±0.14vs0.60±0.05，P<0.05)；與Control組相比較，Control+AG490組 p-STAT3/STAT3比值降低了34% (0.40±0.10vs0.60±0.05，P<0.05) (圖4)。

圖3　體外心肌細胞凋亡檢測

A：Representative photomicrographs of TUNEL-stained cardiomyocytes from different groups. TUNEL-positive nuclei (green)， myoglobin (red)， and DAPI (blue). Scale bar，100 μm.B：Quantitative analysis of TUNEL-positive cells was shown for different groups.C: quantitative analysis of caspase-3 activity was shown for different groups. Values were expressed as means±SE for three independent experiments.*P<0.05vscontrol group，#P<0.05vsI/R group，$P<0.05vsI/R+sRAGE group； sRAGE: soluble receptor for advanced glycation end products； I/R:ischemia/reperfusion.

圖4　體外心肌凋亡相關蛋白表達水平

A：Western blotting analysis for p-STAT3 and t-STAT3. B：quantitative analysis of p-STAT3 to t-STAT3. Values were expressed as means±SE for three independent experiments.*P<0.05vscontrol group，#P<0.05vsI/R group，$P<0.05vsI/R+sRAGE group； sRAGE: soluble receptor for advanced glycation end products； I/R:ischemia/reperfusion； STAT3: signal transducers and activators of transcriptions 3.

3討論

冠心病患者給予再灌注治療后可發生再灌注心肌損傷，目前關于缺血再灌注損傷的確切機制尚未明確，因此，尋找臨床有效干預以降低缺血再灌注損傷仍然是重要的挑戰[14-17]。內源性物質的作用備受關注，其中研究廣泛的內源性物質之一就是sRAGE，關于其在心肌缺血再灌注損傷中的研究也逐漸增多，Bucciarelli 等[18]證實sRAGE 可抑制心肌I/R 時乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)的釋放及改善I/R 導致的心功能降低，此后，Aleshin 等[19]表明sRAGE 可減緩小鼠心肌I/R 炎性反應、減少梗死面積、抑制細胞色素C 的釋放及信號轉導子和轉錄激活子3(signal transducers and activators of transcriptions 3，STAT3)活性的降低。國內學者[12]利用豬心肌I/R 模型證實sRAGE可通過抑制轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的表達而抑制I/R后心肌重構，這些研究均表明，sRAGE具有心臟保護作用，究其保護機制，本課題組前期研究[6]表明，sRAGE的心肌保護作用主要是通過抑制I/R誘導的心肌細胞凋亡實現的。

心肌細胞在I/R 過程中主要有凋亡和壞死兩種死亡方式。細胞凋亡是心肌I/R損傷的主要途徑。凋亡主要由長時間持續缺血或再灌注階段誘發，貫穿于再灌注早期的起始階段、中性粒細胞浸潤的中間階段及數月之后的延遲階段，介導I/R 后心肌梗死范圍擴大、心室重塑及心力衰竭等I/R 損傷的發生。缺血后再灌早期，再灌損傷搶救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)通路激活，包括PI3K/Akt和Erk1/2 MAPK等，而JAK/STAT可通過PI3K/Akt啟動RISK通路的激活。因此，STAT在細胞信號轉導中發揮著至關重要的作用，主要通過將細胞表面的信號轉導至細胞核中，從而調節應激反應基因的表達。Aleshin等[19]證實RAGE-/-和sRAGE處理的小鼠I/R心肌組織中STAT3磷酸化水平明顯增強，同時明顯減輕RAGE介導的心肌損傷，提示sRAGE可通過激活STAT3發揮作用。本研究結果顯示，I/R可明顯降低STAT3的磷酸化水平，增加TUNEL陽性細胞數目及caspase-3活性，而sRAGE預處理后可明顯抑制I/R導致的STAT3的磷酸化水平的降低及心肌細胞的增加，STAT3抑制劑AG490可減弱上述的sRAGE抗凋亡作用。

sRAGE能夠激活STAT3，而sRAGE本身無跨膜段，因此提示sRAGE可能通過激活其他細胞因子進而調節STAT3的活性而發揮保護作用，具體機制尚需進一步驗證。

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編輯陳瑞芳

Effect of STAT3 in soluble receptor for advanced glycation end-products inhibiting myocardial apoptosis induced by ischemia/reperfusion

Guo Caixia1， Jiang Xue1，Zeng Xiangjun2， Chen Buxing1*

(1.DepartmentofCardiology，BeijingTiantanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China；2.DepartmentofPathophysiology，SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

【Abstract】ObjectiveTo test the effect of sRAGE on myocardial apoptosis and STAT3 protein expression with or without STAT3 inhibitor AG490 following ischemia/reperfusion in vivo and in vitro. MethodsC57BL/6J mice undergone left anterior descending coronary artery ligation were used as in vivo model and neonatal rat cardiomyocyte subjected to ischemic buffer as an in vitro model. Apoptosis was detected by TUNEL staining and caspase-3 activity. Expression of STAT3/p-STAT3 protein were detected by Western blotting analysis in the presence and absence of the JAK2 inhibitor AG 490. ResultsIn vivo， compared with sham group， the number of TUNEL positive cells and caspase-3 activity were increased by 115% and 120%， and the ratio of p-STAT3/STAT3 was reduced by 50%； sRAGE (100 μg/day) reduced the TUNEL-positive myocytes by 51%， and activity of caspase-3 by 36%， increased the ratio of p-STAT3/STAT3 by 381% followed by I/R. In vitro， compared with control group， the number of TUNEL positive cells and caspase-3 activity increased by 380% and 77%， and the ratio of p-STAT3/STAT3 was reduced by 69%， sRAGE (900 ng/mL) reduced the TUNEL-positive myocytes by 63%， and caspase-3 activity by 33%， increased the ratio of p-STAT3/STAT3 by 243% followed by I/R. The effect of sRAGE reduction on TUNEL-positive myocytes and caspase-3 activity， raise of the ratio of p-STAT3/STAT3 were attenuated by STAT3 inhibitor AG490. ConclusionThese results suggest that sRAGE protects cardiomyocytes from apoptosis induced by I/R in vitro and in vivo by activating STAT3.

【Key words】sRAGE； myocardial ischemia/reperfusion； apoptosis； STAT3

(收稿日期：2015-12-10)

【中圖分類號】R 541.4

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.009]

*Corresponding author， E-mail：chbux@126.com

基金項目：國家自然科學基金(81570321， 81370313)，北京市科技新星計劃(2010B050)，北京市衛生系統高層次衛生技術人才培養計劃(2013-3-046)資助項目。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81570321， 81370313)，Beijing NOVA Program(2010B050)， Beijing Health System High Level Health Technical Personnel Training Plan(2013-3-046)

網絡出版時間：2016-01-2718∶00網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1800.026.html

· 心腦血管疾病臨床與基礎研究 ·