升麻苷H-1 對腦缺血大鼠紋狀體氨基酸類神經遞質含量的影響*

武密山，　趙素芝，　高維娟，　王　茹，　韓紅偉，　師旭亮

(1河北中醫學院基礎醫學院方劑學教研室，河北 石家莊 050200； 2石家莊市長安區勝北社區衛生服務中心，河北 石家莊 050041； 3河北省心腦血管病中醫藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050091)

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升麻苷H-1 對腦缺血大鼠紋狀體氨基酸類神經遞質含量的影響*

武密山1△，趙素芝2，高維娟3，王茹1，韓紅偉1，師旭亮1

(1河北中醫學院基礎醫學院方劑學教研室，河北 石家莊 050200；2石家莊市長安區勝北社區衛生服務中心，河北 石家莊 050041；3河北省心腦血管病中醫藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050091)

[摘要]目的： 研究腦缺血大鼠腦紋狀體區域細胞外液中氨基酸類神經遞質的表達變化，以探討升麻苷H-1神經保護作用的機制。方法：SD 大鼠隨機分為假手術組、腦缺血組、升麻苷H-1高、中、低劑量組和金納多組。用線栓法造成右側大腦中動脈閉塞(MCAO),建立局灶腦缺血模型，假手術組和腦缺血組分別給予生理鹽水腹腔注射，升麻苷H-1高、中、低劑量組和金納多組分別給予不同劑量的藥物腹腔注射，每天1 次，連續7 d。采用腦微透析技術在大鼠腦紋狀體區域內進行微透析活體采樣，將微透析液注入高效液相-電化學檢測器，檢測樣品中谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)和γ-氨基丁酸(GABA)的含量。結果： 與假手術組相比，腦缺血組的興奮性氨基酸Glu和Asp在腦缺血后2 h濃度升高(P<0.05)。升麻苷H-1高劑量組、金納多組分別與腦缺血組相比，Glu和Asp在腦缺血后2 h顯著降低(P<0.05)；升麻苷H-1低、中劑量組分別與腦缺血組相比，Glu和Asp在腦缺血后2 h 沒有顯著降低(P>0.05)。與假手術組相比，腦缺血組的抑制性氨基酸神經遞質GABA 和Gly在腦缺血后3 h濃度降低(P<0.05)。升麻苷H-1高劑量組、金納多組分別與腦缺血組相比，GABA 和Gly在腦缺血后3 h顯著升高(P<0.05)；升麻苷H-1低、中劑量組分別與腦缺血組相比，GABA 和Gly在腦缺血后3 h 沒有顯著升高。結論：升麻苷H-1可以抑制腦缺血時興奮性氨基酸的過度釋放，并增加抑制性氨基酸的濃度。升麻苷H-1不僅能透過血腦屏障，同時可調節腦缺血興奮性氨基酸神經遞質的功能紊亂，可能對缺血腦組織神經元有一定的保護作用。

[關鍵詞]腦缺血； 升麻苷H-1； 微透析； 天門冬氨酸； 谷氨酸； 甘氨酸； γ-氨基丁酸

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular diseases，ICVD)是老年人中樞神經系統常見病[1]。由于腦部血供不足，相應的局部腦組織缺血缺氧壞死，引起神經損傷，表現為大腦皮層和海馬神經元損傷和死亡、腦組織壞死軟化，從而產生相應腦功能缺損的臨床癥狀。中樞神經系統(central nervous system，CNS)中作為神經遞質的游離氨基酸分兩類：即興奮性氨基酸遞質,如谷氨酸(glutamic acid，Glu)、天門冬氨酸(asparagic acid，Asp)，以及抑制性氨基酸遞質，如γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、甘氨酸(glycine，Gly)。這兩類物質對維持神經系統興奮性和抑制性的平衡起著至關重要的作用，它們的含量與腦缺血密切相關。臨床上許多藥物由于不能通過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)，因此達不到控制腦血管病的作用。毛茛科植物大三葉升麻具有清熱解毒、升舉陽氣、發表透疹的功效，主治風熱頭痛、齒痛、咽喉痛、子宮脫垂等，具有抑制核苷酸轉運、抗病毒、抗腫瘤、抗神經細胞凋亡、調節神經內分泌功能、抗骨質疏松、消炎等多種生理活性[2]。升麻根莖中含有三萜及其苷類、苯丙酸類、色酮類等化合物[3]。阿魏酸和異阿魏酸等苯丙酸衍生物具有抗炎活性，為其質量控制指標[4-5]，是升麻清熱解毒的有效成分。近年的研究表明，升麻中所含的升麻三萜皂苷H-1在升麻中的含量較高，易檢出[6]。本實驗用線栓法造成右側大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)，建立局灶腦缺血大鼠模型，通過微透析(microdialysis，MD)[7]技術觀察腦缺血大鼠紋狀體內氨基酸類神經遞質(Glu、Asp、Gly和γ-GABA)的含量變化及升麻苷H-1的干預，為其調節腦內氨基酸類神經遞質并保護腦缺血后腦組織神經元的作用提供實驗依據。

材料和方法

1材料

1.1藥品與試劑升麻苷H-1自制，經紫外光譜、紅外光譜、質譜、1H核磁共振和13C核磁共振確認結構為升麻苷H-1[8]，如圖1所示。經高效液相色譜(high-performance liquid chromatography, HPLC) 峰面積歸一化法計算純度>98.70%。實驗所用升麻樣品購自石家莊市樂仁堂，經藥用植物教研室王建華教授鑒定。金納多(ginkgo)即銀杏葉提取物注射液，德國威瑪舒培博士藥廠產品，主要用于腦部、周圍血流循環障礙，每支金納多含有銀杏葉提取物17.5 mg，其中銀杏黃酮苷4.2 mg。γ-氨基丁酸、天門冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸標準品(Sigma);磷酸氫二鈉(J．T．Baker);乙腈(Fisher);其它試劑均為分析純。將Ring′s試液(含149 mmol/L NaCl，3 mmol/L KCl，1.2 mmol/L CaCl2，0.8 mmol/L MgCl2，pH 6.7)作為腦內微透析灌流液，由本實驗室配制。

Figure 1.Chemical structure of cimicifugoside H-1.

圖1升麻苷H-1的化學結構式

1.1.1升麻苷H-1提取液的制備(1)色譜條件與系統適應性測試：H&E XP ODS-A 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.4)，流速1.0 mL/min；檢測波長203 nm，柱溫26 ℃，進樣量20 μL，采集時間60 min。在色譜圖中升麻苷H-1 的保留時間為26 min，與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論塔板數為17 000。(2)升麻苷H-1提取液的制備：精密稱取升麻苷H-1 10 mg，加生理鹽水制成每1 mL 含升麻苷H-1 10 mg的溶液，搖勻，即得，低劑量升麻苷H-1含量為10 g/L。

1.1.2人工腦脊液(artifical cerebrospinal fluid, aCSF)的配制分別取：NaCl 7.36 g，CaCl20.12 g，NaHCO32.31 g，MgCl20.17 g，KCl 0.18 g，Na2SO40.07 g，KH2PO40.07 g，加入1 000 mL 蒸餾水，溶解后調pH 7.38，再經孔徑0.2 μm水系微孔濾膜抽濾即得，冰箱內冷藏備用。

1.2儀器與設備腦微透析探針、CMA/12探針套管、CMA/150 低溫樣品自動收集器和CMA-400型針管式微量注射泵(CMA)；BAS 4100 型大鼠腦立體定位儀；牙科鉆(Silite)；Agilent 1200 型HPLC 儀(Agilent)。

1.3實驗動物健康SD 雄性大鼠48只，體重340～360 g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(冀)2003-1-003。

2方法

2.1實驗分組將大鼠隨機分為6 組(n=8)：假手術(sham)組：生理鹽水1.5 mL·kg-1·d-1；腦缺血(cerebral ischemia,CI)組：生理鹽水1.5 mL·kg-1·d-1；金納多(ginkgo)組：5 mL·kg-1·d-1；升麻苷H-1低劑量(SMGL)組：1.5 mL·kg-1·d-1；升麻苷H-1中劑量(SMGM)組：3 mL·kg-1·d-1； 升麻苷H-1高劑量(SMGH)組：6 mL·kg-1·d-1。各組動物均腹腔注射給藥7 d。

2.2模型建立與微透析樣品采集采用朱繼等[9]改進的Longa線拴法制作大鼠MCAO模型。假手術組分離右側頸總動脈后，不結扎，只注射生理鹽水，不再做其它干預措施；金納多和升麻苷H-1不同劑量用藥組分別按照分組設定的要求給藥。大鼠用10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉后，置腦立體定位儀上，下墊恒溫墊，上耳桿，固定門齒，切開頭皮，暴露頭骨，參照George Paxinos 《大鼠腦立體定位圖譜》將探針導管植入左側紋狀體(坐標AP：+0.2 mm；ML：-3.0mm；DV：-3.5 mm)[10]，根據坐標位置顱骨鉆孔，在腦立體定向儀下旋轉垂直臂將微透析探針導軌植入腦紋狀體區，并在顱骨外鉆孔周圍區域呈三角形對稱擰入3顆螺釘后，用牙托粉將導軌與螺絲釘固定成一體，插入微透析探針，穩定平衡90 min，開啟微透析灌流系統，以aCSF為灌流液，調節微量注射泵控制流速恒定為1.5 μL/min，4 ℃下收集腦微透析液，每隔 30 min 收集1管微透析液。每管微透析液收集完畢后均立即置于-20 ℃ 冰箱保存，在透析結束后轉存-80 ℃ 冰箱，擇日測定。探針在使用前做回收率測定，用于折算微透析液中各氨基酸類神經遞質的濃度。

2.34種氨基酸標準液的標準曲線精密稱取Asp、Glu、Gly和γ-GABA 標準對照品各5.0 mg，各用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容在10 mL的容量瓶中，振蕩混勻，得0.5 g/L標準儲備溶液，再分別精密量取2 mL標準儲備液，用50%的甲醇置50 mL的容量瓶定容成20 mg/L的4種氨基酸混合標準液，然后用50% 的甲醇稀釋制成質量濃度為10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25和0.015 625 mg/L的混合氨基酸系列標準溶液。

分別用不同濃度的氨基酸標準液直接在HPLC儀上進行測定，色譜條件與測量樣品時一致，每個濃度的標準液連續進樣檢測3 次。以進樣量的神經遞質濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，利用回歸方程計算標準曲線，Asp、Glu、Gly和γ-GABA的標準曲線與線性相關系數分別為:Y=112.87X+9.34(r=0.998 51)，Y=121.21X+4.87(r=0.998 72)，Y=222.75X+34.43(r=0.998 47)，Y=213.42X+25.85(r=0.998 72)。

2.4HPLC-電化學檢測器(electrochemical detector,ECD)分析流動相配置：測定流動相每升含0.1 mol/L 乙二胺四乙酸二鈉1 mL，0.15 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液828 mL，1-烷基硫酸鈉0.281 g，甲醇150 mL。設定流動相流速為0.7 mL/min，柱溫箱溫度為28 ℃。ECD工作電壓為200 mV、400 mV和600 mV，分別為2、3和4 通道；增益為2 nA。進樣量為25 μL。

3統計學處理

根據以上建立的分析方法，以標準曲線計算每只動物給藥后每個樣品各個時點的測定值濃度，統計每組動物的透析濃度采用均數±標準差(mean±SD)表示，所測數據使用SPSS 13.0 統計軟件進行分析，采用組間t檢驗并進行方差分析比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1升麻苷H-1不同劑量組對腦缺血大鼠紋狀體區興奮性氨基酸(Glu和Asp)濃度變化的比較

與假手術組相比，腦缺血組Glu和Asp在腦缺血后2 h濃度達到最高(P<0.05)，之后逐漸回降。升麻苷H-1高劑量組、金納多組分別與腦缺血組相比，Glu和Asp在腦缺血后2 h 顯著降低(P<0.05)；升麻苷H-1低、中劑量組分別與腦缺血組相比，Glu和Asp在腦缺血后2 h 沒有顯著降低,見圖2、3。

Figure 2.Effects of cimicifugoside H-1 at different doses on the content of glutamic acid (Glu) in striatum of rats with cerebral ischemia. Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vscerebral ischemia group at 2 h.

圖2升麻苷H-1不同劑量組對腦缺血大鼠紋狀體區Glu濃度隨時間變化的影響

Figure 3.Effects of cimicifugoside H-1 at different doses on the content of aspartic acid (Asp) in striatum of rats with cerebral ischemia. Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vscerebral ischemia group at 2 h.

圖3升麻苷H-1不同劑量組對腦缺血大鼠紋狀體區Asp濃度隨時間變化的影響

2升麻苷H-1不同劑量組對腦缺血大鼠紋狀體區抑制性氨基酸(GABA 和Gly)濃度變化的比較

與假手術組相比，腦缺血組GABA 和Gly在腦缺血后3 h濃度降到最低(P<0.05)，之后逐漸回升。升麻苷H-1高劑量組、金納多組分別與腦缺血組相比，GABA 和Gly在腦缺血后3 h 顯著升高(P<0.05)；升麻苷H-1低、中劑量組分別與腦缺血組相比，GABA 和Gly在腦缺血后3 h 沒有顯著升高,見圖4、5。

Figure 4.Effects of cimicifugoside H-1 at different doses on the content of γ-aminobutyric acid (GABA) in striatum of rats with cerebral ischemia. Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vscerebral ischemia group at 3 h.

圖4升麻苷H-1不同劑量組對腦缺血大鼠紋狀體區GABA濃度隨時間變化的影響

Figure 5.Effects of cimicifugoside H-1 at different doses on the content of glycine (Gly) in striatum of rats with cerebral ischemia. Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vscerebral ischemia group at 3 h.

圖5升麻苷H-1不同劑量組對腦缺血大鼠紋狀體區Gly濃度隨時間變化的影響

討論

中樞神經系統內廣泛分布著大量的氨基酸，它們在感覺信息傳導和完成運動指令等突觸的神經遞質傳遞中發揮重要作用。谷氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸和天門冬氨酸是腦內主要的氨基酸(其中GABA主要是三羧酸循環中的Glu在谷氨酸脫羧酶誘導下生成的)，根據其對突觸后神經元的興奮或抑制作用，可分為興奮性氨基酸和抑制性氨基酸兩類。

興奮性氨基酸Glu和Asp對缺血性腦損傷起重要作用[11]。生理條件下，Glu 主要作為興奮性突觸的神經遞質，同時又是GABA 的前體物質。若Glu濃度過高，則產生神經毒性，神經元及神經膠質細胞膜上的Glu 轉運體在Glu毒性發生之前能很快清除突觸釋放的Glu[12]。Glu 發揮作用主要是通過兩類受體介導。一類是離子型受體(iGluRs)，屬于配體門控性離子通道，介導快信號傳遞，根據激動劑不同分為3種受體，即N-甲基-D-天冬氨酸(N-methy-D-aspartate，NMDA)、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA)和海人藻酸。NMDA 受體對Ca2+有通透性，多存在于由皮質到紋狀體的投射神經元中；AMPA 受體對Na+、K+及Ca2+有通透性，多存在于底丘腦核、蒼白球內、外側部等核團中。另一類是代謝型受體(mGluRs)，屬于G蛋白偶聯受體，需要第二信使的介導。mGluRs目前已發現8 個亞型：mGluR1～mGluR8，按其受體蛋白的序列同源性，可分為3 組，第1組包括mGluR1和mGluR5，作用是抑制超極化電流，使神經元興奮性增高；第2組包括mGluR2與mGluR3，激活G蛋白門控的內向整流K+通道使神經元發生超極化，興奮性降低；第3組包括mGluR4和mGluR6，7，8，可通過突觸調制改變Glu 自身及GABA 的釋放及突觸的可塑性，間接改變神經元的電活動。腦缺血后，首先出現Ca2+依賴性的氨基酸神經遞質釋放，而后能量喪失可使細胞膜內外離子濃度比例失衡，胞內Na+及胞外K+濃度的升高使非Ca2+依賴性的Glu 轉運體功能翻轉[13]，使神經元及膠質細胞Glu外溢，胞外含量上升；除了缺血中心出現組織壞死，缺血區域周圍的神經細胞也出現緩慢壞死；Glu過度釋放通過激動NMDA、AMPA受體和代謝性谷氨酸受體，影響離子通道；不適當的Ca2+內流引起神經細胞壞死或者凋亡，造成腦缺血損害。

抑制性氨基酸GABA和Gly對腦缺血損傷后果有明顯影響[14]。GABA受體可分為促離子型受體(GABAa 受體)與促代謝型受體(GABAb 受體)。GABAa受體是一種配體門控的Cl-通道，位于中樞突觸后膜，通過與GABA 結合，增加Cl-在神經細胞膜內外的流動，興奮時Cl-內流增加，誘發去極化，興奮性下降，產生早抑制性突觸后電位。GABAb 為G 蛋白偶聯受體，興奮時K+通道增加，減少Ca2+內流。抑制性氨基酸的增加可抑制神經元興奮，減少由于興奮性氨基酸造成的神經細胞損傷。

BBB是影響中樞神經系統藥物作用的主要障礙。毛茛科植物大三葉升麻，入脾、胃、肺、大腸經，在補中益氣湯中作為向上升提的藥引子“升清陽之氣”，使下陷之清陽上升而恢復其本位。腦為至清至高之清靈之體，腦為氣血精華匯集之處。從中藥升降浮沉的作用趨勢看：升浮藥向上、升陽、開竅均可“歸經入腦”。升麻是否能升清陽而“歸經入腦”？

金納多是治療腦缺血有效藥物，與升麻苷同屬于苷類，有可比性，故用作對照治療。本實驗發現，升麻苷H-1不僅能透過BBB，還可以抑制腦缺血時興奮性氨基酸的過度釋放，減少由于興奮性氨基酸造成的神經細胞損傷，同時增加抑制性氨基酸的濃度，抑制神經元興奮，對缺血腦組織神經元有一定的保護作用。詳細的藥理學機制仍需進一步研究。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Effect of cimicifugoside H-1 on amino acid neurotransmitters in striatum of rats with cerebral ischemia

WU Mi-shan1, ZHAO Su-zhi2, GAO Wei-juan3, WANG Ru1, HAN Hong-wei1, SHI Xu-liang1

(1DepartmentofFormulaology,BasicMedicineCollege,HebeiUniversityofChineseMedicine,Shijiazhuang050200,China;2Chang’anDistrictShengbeiCommunityHealthCenterofShijiazhuang,Shijiazhuang050041,China;3HebeiKeyLaboratoryofChineseMedicineonCardio-CerebrovascularDisease,Shijiazhuang050091,China.E-mail:wumishan6@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the neuroprotective effect of cimicifugoside H-1 and to explore the mechanism involved by determining the variation of amino acid neurotransmitters in extracellular fluid in the striatum of rats with cerebral ischemia. METHODS: The rats were randomly divided into sham-operated, cerebral ischemia, high-, middle- and low-dose cimicifugoside H-1, and ginkgo groups. Focal cerebral ischemia model was established by middle cerebral artery occlusion (MCAO) with sutures. Normal saline was intraperitoneally injected into the rats in sham-operated group and cerebral ischemia group, while ginkgo and different doses of cimicifugoside H-1 were injected into the rats in ginkgo group and high-, middle- and low-dose cimicifugoside H-1 groups, respectively, once a day for 7 d. The striatal fluids were gained in vivo by brain microdialysis. The contents of aspartic acid， glutamic acid, glycine and γ-aminobutyric acid were tested by high-performance liquid chromatography electrochemical detector system. RESULTS: Compared with sham-operated group, the contents of excitatory amino acids (aspartic acid and glutamic acid) were significantly increased 2 h after cerebral ischemia (P<0.05). Compared with cerebral ischemia group, the contents of aspartic acid and glutamic acid were significantly decreased 2 h after cerebral ischemia in high-dose cimicifugoside H-1 and ginkgo groups (P<0.05). Compared with cerebral ischemia group, the contents of aspartic acid and glutamic acid did not show significant decrease 2 h after cerebral ischemia in middle- and low-dose cimicifugoside H-1 groups. Compared with sham-operated group, the contents of inhibitory amino acid (γ-aminobutyric acid and glycine) were significantly decreased 3 h after cerebral ischemia in cerebral ischemia group (P<0.05). Compared with cerebral ischemia group, the contents of γ-aminobutyric acid and glycine were significantly increased 3 h after cerebral ischemia in high-dose cimicifugoside H-1 and ginkgo groups (P<0.05). Compared with cerebral ischemia group, the contents of γ-aminobutyric acid and glycine did not show significant decrease 3 h after cerebral ischemia in middle- and low-dose cimicifugoside H-1 groups. CONCLUSION: Cimicifugoside H-1 restrains the excessive releases of excitatory amino acids and increases the contents of inhibitory amino acids during cerebral ischemia. It doesn’t only penetrate through the blood brain barrier, but also regulates the disorder of excitatory amino acid during cerebral ischemia, thus showing the protective function to cerebral neuron during cerebral ischemia.

[KEY WORDS]Cerebral ischemia; Cimicifugoside H-1; Microdialysis; Aspartic acid; Glutamic acid; Glycine; γ-Aminobutyric acid

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0831- 05

[收稿日期]2015- 11- 12[修回日期] 2016- 02- 12

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.81073074;No.30472200)；河北省自然科學基金資助項目(No.H 2013206005)；河北省高等學校科學技術研究重點項目(No.ZD2015053)；河北省高等學校高層次人才科學研究項目(No.GCC2014013)

通訊作者△Tel: 0311-89926738; E-mail: wumishan6@sina.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.010

雜志網址： http://www.cjpp.net