心腎綜合征中硫酸吲哚酚對巨噬細胞吞噬氧氣型低密度脂蛋白的誘導作用的研究*

國春玲，施海濤，戚擁軍，何平，張志任

（齊齊哈爾醫學院附屬第五醫院大慶龍南醫院1.腎內科；2.兒科；3.呼吸科，黑龍江大慶163453；4.哈爾濱醫科大學，黑龍江哈爾濱150081）

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心腎綜合征中硫酸吲哚酚對巨噬細胞吞噬氧氣型低密度脂蛋白的誘導作用的研究*

國春玲1，施海濤1，戚擁軍2，何平3，張志任4

（齊齊哈爾醫學院附屬第五醫院大慶龍南醫院1.腎內科；2.兒科；3.呼吸科，黑龍江大慶163453；4.哈爾濱醫科大學，黑龍江哈爾濱150081）

摘要：目的探討硫酸吲哚酚（IS）對RAW264.7巨噬細胞吞噬氧氣型低密度脂蛋白（ox-LDL）的誘導作用及其作用機制。方法0、10、50、100、200和400μmol/L IS處理RAW264.7細胞24 h，采用CCK-8法測定RAW264.7細胞存活率，流式細胞術測定RAW264.7細胞的Dil標記氧化型低密度脂蛋白（Dil-ox-LDL）吞噬量。200μmol/L IS處理RAW264.7細胞0、12、24、36和48 h，測定RAW264.7細胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量。IS組RAW264.7細胞用200μmol/L IS處理24 h，UO126+IS組RAW264.7細胞以5μmol/L UO126預處理2 h后再200μmol/L IS處理24 h，測定非處理組、IS組和UO126+IS組RAW264.7細胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量，并采用蛋白質印跡法（Western blot）檢測在IS刺激15 min時的ERK1/1蛋白表達情況。結果IS對RAW264.7細胞存活率的濃度效應和時間效應檢測中，不同組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。Dil-ox-LDL吞噬量與IS浸潤濃度及處理時間均呈正相關（P＜0.01）。IS組的Dil-ox-LDL吞噬量和磷酸化ERK1/2蛋白表達量均明顯高于非處理組（P＜0.01）。UO126+IS組的Dil-ox-LDL吞噬量略低于非處理組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；磷酸化ERK1/2蛋白表達量大幅低于非處理組，差異有統計學意義（P＜0.01）。UO126+IS組同IS組比較，Dil-ox-LDL吞噬量和磷酸化ERK1/2蛋白表達量均呈現大幅降低（P＜0.01）。結論IS可在體外直接誘導RAW264.7巨噬細胞吞噬ox-LDL，該效應經由活躍MAPK信號轉導通路實現，且隨IS濃度升高和浸潤時間延長而增強。

關鍵詞：硫酸吲哚酚；心腎綜合征；慢性腎??；動脈粥樣硬化；ox-LDL；RAW264.7巨噬細胞

BONGARTZ的“心腎連接”理論明確指出心或腎功能受損均會引發交感神經系統、腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）和炎癥因子的一系列波動，共同推動心腎功能進一步衰損［1-2］，以此為基礎不斷深入探索，心腎綜合征（cardiorenal syndrome，CRS）的概念逐步成熟。流行病學調查顯示，腎功能損傷提升充血性心力衰竭（congenital heart failure，CHF）的患病率15倍甚至更多，引發心血管死亡事件的可能性激增20倍。同樣，約1/4的CHF病人并發有腎功能損傷，進一步發展至腎透析的危險性是普通人的5倍［3-5］。心腎體系的多因素交互影響令CRS的病理進程更加復雜多變，目前對于其發病機制仍缺乏明確闡釋，使得治療手段單一且被動。因此，探索心腎之間的惡性互動機制對于CRS的防治意義非凡。慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）患者是動脈粥樣硬化的高發人群，而尿毒癥毒素是CKD成病過程中不容忽視的致病因子［6］，尤其是蛋白結合類毒素，令現有的血液凈化手段事倍功半［7］。硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS）即是該類物質中最重要的成員之一，近年來成為心腎醫學研究人員的關注重點。已有動物實驗證實，IS清除不利會使缺失載脂蛋白E基因小鼠的主動脈斑塊加速形成并惡化［8］，但目前關于IS推動動脈粥樣硬化發生進展的具體機制少見報道，而巨噬細胞吞噬脂滴后泡沫化正是強直性脊柱炎病發的關鍵節點，所以本研究著眼于IS對巨噬細胞內吞噬氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）的誘導作用并初步探討其機制，希望為防治CRS提供新的方向指導。現報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗細胞、材料和方法

建立6個IS濃度級且每級同時進行平行樣本3孔：①傳代培養至對數期的RAW264.7巨噬細胞（中科院上海細胞所）經消化、稀釋至濃度2×104個/ml，接入96孔板0.1 ml/孔，置二氧化碳CO2培養箱（上海喆圖科學儀器有限公司）生長，貼壁后更換稀釋有IS（美國Sigma公司）的新鮮培養基，并使每孔中IS濃度分別為0、10、50、100、200和400μmol/L，待IS浸潤24 h后沿孔壁加入0.01 ml/孔CCK-8試劑，充分反應4 h后依照CCK-8試劑盒（上海勵瑞生物科技有限公司）方法檢測細胞活力（A450），重復實驗3次考察不同濃度IS對RAW264.7細胞存活率的影響；②另取細胞懸液接入12孔板2×105個/孔，置適宜環境生長，其后處理步驟同①，直至IS浸潤18 h后每孔再加入Dil標記氧化型低密度脂蛋白（Dil-ox-LDL）（北京協生生物科技有限責任公司），成20 g/ml，繼續培養6 h后傾出培養液，經沖洗、吹打、離心再稀釋成適宜濃度細胞懸液，上BD FACSCalibur流式細胞儀（北京東迅天地醫療儀器有限公司）測定熒光強度，重復實驗3次考察不同濃度IS對RAW264.7細胞吞噬Dil-ox-LDL能力的影響。

建立5個時間級且每級同時進行平行樣本3孔：①RAW264.7細胞經消化、稀釋至濃度2×104個/ ml，接入96孔板0.1 ml/孔置適宜環境生長，貼壁后更換新鮮培養基繼續培養48 h，并于對應時間點加入IS使成200μmol/L，待IS分別浸潤0、12、24、36和48 h后沿孔壁加入0.01 ml/孔CCK-8試劑，充分反應4 h后依照CCK-8試劑盒方法檢測細胞活力（A450），重復實驗3次考察IS作用不同時間對RAW264.7細胞存活率的影響；②另取細胞懸液接入12孔板2×105個/孔置適宜環境生長，其后處理步驟同①，直至IS分別浸潤0、12、24、36和48 h后每孔再加入Dil-ox-LDL，成20 g/ml，繼續培養6 h后傾出培養液，經沖洗、吹打、離心再稀釋成適宜濃度細胞懸液，上流式細胞儀測定熒光強度，重復實驗3次考察IS作用不同時間對RAW264.7細胞吞噬Dil-ox-LDL能力的影響。

建立3組且同時進行平行樣本3孔：①濃度2×104個/ml細胞懸液接入96孔板0.1 ml/孔置適宜環境生長，貼壁后UO126+IS組更換稀釋有5μmol/L UO126（上海賽鑫生物技術有限公司）的新鮮培養液，非處理組和IS組更換等量新鮮培養液，2 h后IS組和UO126+IS組再添加IS使成200 μmol/L，待IS浸潤24 h后沿孔壁加入0.01 ml/孔CCK-8試劑，充分反應4 h后依照CCK-8試劑盒方法檢測細胞活力（A450），重復實驗3次考察各組RAW264.7細胞存活率的差異；②另取細胞懸液接入12孔板2×105個/孔置適宜環境生長，其后各組處理步驟同①，直至IS浸潤18 h后各組每孔再加入Dil-ox-LDL使成20 g/ml，繼續培養6 h，經沖洗、吹打、離心再稀釋成適宜濃度細胞懸液，上流式細胞儀測定熒光強度，重復實驗3次考察各組Dil-ox-LDL吞噬量的差異；③取細胞懸液接入培養瓶1× 106個/瓶置適宜環境生長，其后處理步驟同①，待IS浸潤15 min后傾出培養液，經沖洗、吹打、離心再分離蛋白，電泳、轉膜及染色后，以一抗磷酸化及總ERK（p44/42）單克隆抗體和二抗辣根過氧化物酶標記的抗兔免疫球蛋白G抗體分別孵育再曝光，蛋白印跡法（Western blot）法測定胞內細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2）蛋白表達量，重復實驗2次考察各組蛋白表達量的差異。

1.2統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，細胞存活率、Dil-ox-LDL吞噬量及蛋白表達量用均數±標準差（±s）表示。對于各濃度級和時間級，以及非處理組、IS組和UO126+IS組的數據，若符合方差齊性則多組間比較采用ANOVA分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗；若不符合方差齊性則多組間比較采用Kendall’s W檢驗，兩組間比較采用Tamhane’s檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1IS對RAW264.7細胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量的濃度效應

表1　IS對RAW264.7細胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量的時間效應

圖1　IS對RAW264.7細胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量的濃度效應

如表1和圖1。分別以IS濃度0測得的細胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量為參照標準，IS浸潤濃度不同的各組間細胞存活率略有升降，差異無統計學意義（P＞0.05）；但各組Dil-ox-LDL吞噬量隨IS浸潤濃度增大明顯升高，且比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2IS對RAW264.7細胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量的時間效應

分別以IS浸潤時間0 h測得的細胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量為參照標準，IS浸潤時間不同的各組間細胞存活率略有升降，差異無統計學意義（P＞0.05）；但各組Dil-ox-LDL吞噬量隨IS浸潤時間延長明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖2。

2.3各組RAW264.7細胞存活率、Dil-ox-LDL吞噬量和ERK1/2蛋白表達量的比較

分別以非處理組測得的細胞存活率、Dil-ox-LDL吞噬量、蛋白表達量為參照標準。與非處理組數值比較，IS組和UO126+IS組的細胞存活率及總ERK1/2蛋白表達量均略低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。同時，IS組的Dil-ox-LDL吞噬量和磷酸化ERK1/2蛋白表達量均明顯高于非處理組，且差異有統計學意義（P＜0.01）。UO126+IS組的Dil-ox-LDL吞噬量與非處理組比較略低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；磷酸化ERK1/2蛋白表達量大幅低于非處理組，差異有統計學意義（P＜0.01）。此外，UO126+IS組與IS組比較，細胞存活率及總ERK1/2蛋白表達量雖有升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；Dil-ox-LDL吞噬量和磷酸化ERK1/2蛋白表達量均呈現大幅降低，且差異有統計學意義（P ＜0.01）。見表2和圖3、4。

圖2　IS對RAW264.7細胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量的時間效應

圖3　各組總ERK1/2蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白的比較

圖4　各組RAW264.7細胞存活率、Dil-ox-LDL吞噬量和ERK1/2蛋白表達量的比較

表2　3組間細胞存活率、Dil-ox-LDL吞噬量和ERK1/2蛋白表達量的比較

3　討論

人體是高度精密的“儀器”，各臟器之間既分工明確又協同合作。心腎是高效平穩的生命運作最重要的兩大部分，共同承擔著維持血液動力學穩定和體液平衡等多重重任［9］，生理功能的密切相關直接決定了兩者在病理過程的交互影響。自1840年PIORRY、HERITIER定義尿毒癥以來，已有200余種毒素被成功鑒定，它們在心腎、血管、神經和免疫系統等的衰退中扮演著重要的角色［10］。健康人體可經腎臟將攝入氨基酸轉化而來的IS及時“掃地出門”，進出均衡狀態下IS不會在血液中游離存在，而在CKD患者體內，清除率下降極易造成IS存積于腎單元，器質性的損傷又進一步加深腎功缺失陷入“死循環”［11-12］。此外，過剩IS游離入血引發血清濃度激增，使得心血管疾病風險飆升［13-14］，已有研究證實，血清IS不僅上調P53、P21基因表達誘使平滑肌細胞衰亡［15］，而且調控Klotho蛋白表達引導內皮細胞障礙［16］。所以，IS在CRS整個病程中推波助瀾不容忽視，同時也極有可能成為預防病發、延緩病情發展的決定性突破口。

本次研究發現，IS并未對RAW264.7巨噬細胞表現直接抑制作用，但RAW264.7細胞吞噬Dil-ox-LDL總量對IS浸潤濃度和時間均呈現正相關。ox-LDL是強直性脊柱炎起病的根源，全面參與病情進展的各個階段，巨噬細胞則是人體健康的忠誠衛士，負責辨識和掃清入侵內部的“搗亂分子”。巨噬細胞將盡可能多ox-LDL吞納入體內，自身也受其毒性影響逐漸凋亡泡沫化，包裹有大量脂質的巨噬源性泡沫細胞黏集于受損的血管壁內表面開啟了強直性脊柱炎最早的病變序幕—脂質條紋［17-18］。健康人體和CKD患者的血清IS含量差異巨大，正常IS血清濃度不足10μmol/L，研究中該濃度尚未能對ox-LDL吞噬量產生明顯影響；CKD患者IS血清濃度均值高達100～200μmol/L［19］，而本次結果清晰顯示，50～400μmol/L IS的存在均可誘導增效RAW264.7細胞吞噬ox-LDL。而且ox-LDL吞噬量隨IS浸潤時間延長而急劇升高也表明，高濃度IS在體內滯留時間越長，巨噬細胞泡沫化情況越嚴重。

筆者發現，在IS的作用下，隨ox-LDL吞噬量激增的還有RAW264.7細胞內磷酸化ERK1/2蛋白表達量，當以UO126專屬性阻斷ERK1/2蛋白表達的上游通路時，UO126+IS組的Dil-ox-LDL吞噬量回落至未處理組同等水平，伴隨磷酸化ERK1/2蛋白表達量大幅降低。因此推斷，IS對RAW264.7細胞吞噬氧化低密度脂蛋白的誘導增強作用同MAPK信號轉導通路存在密切聯系。如果將細胞視作城堡，表面受體即為駐守邊疆的“情報接收站”，細胞核擔當“中央指揮部”，MAPK信號轉導通路是負責將信息由外向內傳送的主要驛道，ERK1/2則是路途上最重要的信使之一［20］。ERK1/2平時游走于胞質間待命，只有被Raf磷酸化激活后才能迅速蘇醒，攜帶信息穿透入核。IS增強RAW264.7細胞對ox-LDL的吸收可能是介由引發RAW264.7表面特異辨識氧化低密度脂蛋白的清道夫受體和CD36異常興奮，使MAPK信號轉導通路高度活躍，活化ERK1/2蛋白量提升。UO126有效截斷了MAPK的級聯反應，得以抑制IS對RAW264.7細胞吞噬氧化低密度脂蛋白的誘導增強作用。

綜上所述，IS經由活躍MAPK信號轉導通路，激動ERK1/2蛋白實現對巨噬細胞吞噬ox-LDL的誘導增效作用，且該效應隨IS濃度升高和浸潤時間延長而增強。所以及時有效地排除患者體內IS可在一定程度上避免和緩解動脈粥樣硬化危機，有利于CRS的良好預后。

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（張蕾編輯）

論著

Induction effect of indoxyl sulfate on uptake of ox-LDL by macrophages*

Chun-ling Guo1，Hai-tao Shi1，Yong-jun Qi2，Ping He3，Zhi-ren Zhang4
（1. Department of Nephrology；2. Department of Pediatrics；3. Department of Respiratory Diseases，Daqing Longnan Hospital of the Fifth Hospital Affiliated to Qiqihar Medical School，Daqing，Heilongjiang 163453，China；4. Harbin Medical University，Harbin，Heilongjiang 150081，China）

Abstract：Objective To investigate the induction effect and mechanism of indoxyl sulfate（IS）on uptake of ox-LDL by RAW264.7 macrophages. Methods RAW264.7 cells were treated with 0，10，50，100，200 and 400 μmol/L IS for 24 h. CCK-8 assay was employed to obtain the cell survival ratio of RAW264.7 cells，and flow cytometry was employed to detect uptake of ox-LDL by RAW264.7 cells. After RAW264.7 cells were treated with 200 μmol/L IS for 0，12，24，36 and 48 h，and the cell survival ratio and uptake of ox-LDL were obtained. RAW264.7 cells of the IS group were treated with 200 μmol/L IS for 24 h，while the cells of the UO126+IS group were treated with 5 μmol/Lbook=26,ebook=31UO126 for 2 h in advance and 200 μmol/L IS for 24 h. Then the survival ratio of RAW264.7 cells and uptake of ox-LDL were determined in the non-treated group，IS group and UO126+IS group. And Western blot was used to detect the expression of ERK1/2 protein in the three groups. Results In the detection of dose-dependent effects and time-dependent effects of IS on RAW264.7 cell survival ratio，there was no significant difference between the groups （P＞0.05）. Uptake of Dil-ox-LDL positively correlated with the concentration of IS and the action time（P＜0.01）. Uptake of Dil-ox-LDL and the expression of p-ERK1/2 of the IS group were greatly higher than those of the nontreatment group（P＜0.01）. Uptake of Dil-ox-LDL of the UO126+IS group was slightly lower than that of the nontreatment group，and the difference was no statistically significant（P＞0.05）. While the expression of p-ERK1/2 of the UO126+IS group was obviously lower than that of the non-treatment group（P＜0.01）. Uptake of Dil-ox-LDL and the expression of p- ERK1/2 of the UO126+IS group were significantly lower than those of the IS group（P＜0.01）. Conclusions IS can directly induce uptake of ox-LDL by RAW264. 7 macrophages in vitro through activation of MAPK signaling pathway，and the effect is enhanced with increasing concentration and action time.

Keywords：indoxyl sulfate；cardiorenal syndrome；chronic kidney disease；atherosclerosis；ox-LDL；RAW264.7 macrophage

中圖分類號：R692

文獻標識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.006

文章編號：1005-8982（2016）10-0025-06

收稿日期：2015-11-19

*基金項目：2012年度高等學校博士學科點專項科研基金（No：20122307110008）