胸腹水液基薄層細胞涂片中Ki-67的表達聯合CA153、CYFRA211、CEA的檢測與胸腹水良惡性質的相關性

王翠峰 任美英 付玉華 楊麗

胸腹水液基薄層細胞涂片中Ki-67的表達聯合CA153、CYFRA211、CEA的檢測與胸腹水良惡性質的相關性

王翠峰 任美英 付玉華 楊麗

目的 本實驗通過選用單克隆抗體Ki-67標記胸腹水液基薄層細胞涂片，并聯合定量分析CA153、CYFRA211及CEA等三項腫瘤標志物在胸腹水中的含量，對比這幾種檢測指標的不同檢測組合的效能評價來鑒別胸腹水的良、惡性質。方法 本實驗共收集惡性組胸腹水標本51例，良性組胸腹水標本34例，對每份標本部分采用免疫細胞化學染色法檢測液基薄層細胞涂片中Ki-67表達及半定量分析，其余部分檢測腫瘤標志物CA153、CYFRA211及CEA的含量，后分別對4項指標單獨及聯合檢測的不同組合進行效能評價。結果 惡性組中胸腹水Ki-67的表達分析及CYFRA211、CEA含量均高于良性胸腔積液組，差異有統計學意義（P<0.05）。在效能評價中，4個項目單獨檢測胸腹水時，敏感度和陰性預測值最低的是CA153、特異性最低的是CYFRA211、陽性預測值最低的是CEA。當兩兩組合檢測中Ki-67和CYFRA211的敏感性最高，可達98.0%，但特異性最低。而Ki-67和CA153聯合檢測，特異性盡管最高，達76.4%，但敏感性卻最低，為88.3%。而在3項組合中，每種組合均可將敏感性提高到90.0%以上，但特異性卻比單項檢測或兩兩結合檢測的結果均低。而當以上4項指標共同聯合檢測時敏感度為100.0%，而特異性卻為幾種檢測方式中的最低，為44.1%。結論 分析所測結果，細胞免疫組化Ki-67的表達聯合CEA、CYFRA211檢測可將惡性胸腹水診斷的敏感性提高到98.0%，而特異性也可達到70.5%，從而成為在鑒別胸腹水良、惡性質中最大互補作用的項目組合。

Ki-67；胸腹水；液基薄層細胞制片；免疫細胞化學染色；腫瘤標志物

胸腹水是臨床上常見的一種并發癥，可由許多疾病引起，其中由于惡性腫瘤引起的胸腹水，是惡性腫瘤侵襲和轉移的一個突出的臨床表現，約占所有胸腹水病因的10%～15%，患者出現惡性胸腹水常提示腫瘤已到終末期，預后極差[1]。故對于臨床來說，準確判斷積液的性質對疾病的診斷和治療至關重要。但目前對胸腹水性質判斷仍未有較有效的方法。而本實驗通過選用單克隆抗體Ki-67標記經液基薄層方法（TCT）制備的胸腹水的細胞學涂片，并聯合定量分析CA153、CYFRA211及CEA等3項腫瘤標志物在胸腹水中的含量，試通過對比這幾種檢測指標的聯合檢測來尋求鑒別良、惡性胸腹水的客觀指標，以指導臨床治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗所用的胸腹水標本均來自內蒙古包頭醫學院第一附屬醫院的檢驗科細胞病理室，2011年1月～2012年6月入院且為初治的患者，同時最終診斷明確者85例，其中惡性胸腹水（惡性組）51例，男25例，女26例，年齡34～86歲，平均（61.36±9.1）歲，均經胸腹水脫落細胞學檢查、閉式經皮胸膜活檢、纖維支氣管鏡檢查、淺表淋巴結穿刺等檢查獲得病理組織學或細胞學依據而確診。良性胸腹水（良性組）34例，其中男18例，女16例，年齡33～80歲，平均（58.16±10.7）歲，良性組均根據病史、臨床表現、胸腹水細菌性檢查、結核菌素試驗、X線胸片或胸部CT檢查、閉式經皮胸膜活檢臨床相關資料的綜合分析確定診斷。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本采集 取臨床新鮮抽取的胸腹水100～200 mL,分裝5～10mL標本用于3項腫瘤標志物的定量檢測，其余量用于細胞涂片的制作。

1.2.2 制作液基涂片 將收集到的新鮮的胸腹水標本混勻后離心，棄去上清將約1～2mL沉淀物加入到EasyFix細胞固定液中，按TCT制片方法進行制片，每一份標本至少制片5張。取1～2張玻片標本進行瑞氏染色，其余的通過乙醇固定液固定20 min用于免疫細胞化學染色。

1.2.3 免疫細胞化學染色 惡性組和良性組的玻片標本均采用免疫組化SP法，以PBS液代替一抗作陰性對照，陽性對照用已知Ki-67陽性的肺癌切片作。按照試劑說明書操作步驟進行免疫細胞化學染色。鼠抗人Ki-67單克隆抗體（即用型）、即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒、DAB顯色試劑盒均購于福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.4 胸腹水中腫瘤標志物CA153、CYFRA211及CEA含量檢測 采用化學發光法嚴格按照羅氏全自動化學發光免疫分析儀和試劑的SOP文件和使用說明書進行操作。

1.2.5 圖像分析及統計學處理 單克隆抗體Ki-67主要定位于增殖期的細胞核。細胞核呈棕黃色顆粒即為Ki-67陽性表達，陰性細胞的細胞核被蘇木素復染為藍紫色。每張玻片隨機計數10個高倍視野（×200）進行陽性細胞計數：陽性細胞標記指數(labeling index,LI)=視野陽性細胞數/100×100%，分組統計時采用平均標記指數(MLI)。再用捷達801圖像分析系統分別測定良性組和惡性組胸腹水中陽性細胞面積積分光密度值（area integrated optical density,AIOD），用陽性積分光密度值/ μm2表示Ki-67蛋白表達的相對含量，每張涂片在光學顯微鏡高倍視野下，隨機測2個單位面積，并記錄數據。

1.2.6 標志物檢驗判斷標準 各項腫瘤標志物正常值分別為：CEA<9.8ng/mL，CYFRA211：<3.3ng/mL，CA153<28U/mL，超過正常值即判斷為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件包對所有數據進行統計學分析，對于Ki-67的實驗數據均數比較采用t檢驗。計數資料采用“%”表示，應用χ2檢驗。因腫瘤標志物的數據為偏態分布資料，故統計腫瘤標志物水平用中位數±四分位數間距表示。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 惡性組與良性組的一般臨床資料比較 2組患者在性別和年齡構成上均差異無統計學意義。見表1、表2。

表1 惡性組與良性組性別構成比較

表2 惡性組與良性組年齡比較（x±s）

2.2 胸腹水良、惡性組免疫細胞化學染色檢測Ki-67表達結果 51例惡性胸腹水標本中42例見到Ki-67抗原的陽性表達，表達的陽性率為82.3%；良性組的僅為11.7%，且均為弱表達，二者之間差異有統計學意義（P<0.05）。見表3、表4。后經圖像分析系統分析結果顯示胸腹水中ki-67陽性細胞平均標記指數（MLI）結果以及陽性細胞的面積積分光密度值均顯示出良性組與惡性組相比差異有統計學意義（P<0.05）。見表5、表6。

表3 良惡性胸腹水中Ki-67表達的結果

表4 良惡性胸腹水中Ki-67免疫組化染色結果

表5 良惡性胸腹水中Ki-67陽性細胞MLI結果（x±s）

表6 Ki-67在良惡性胸腹水中陽性細胞面積積分光密度值（x±s）

2.3 胸腹水良、惡性組腫瘤標志物水平比較 惡性組中胸腹水CEA、CYFRA211均高于良性胸腔積液組，差異有統計學意義（P<0.05）。而CA153在良、惡性胸腹水中的測定結果差異無統計學意義。見表7。

表7 良、惡性胸腔積液組胸水腫瘤標志物水平比較（M±Q）

2.4 單項檢測胸腹水中CEA、CA153、CYFRA211及Ki-67的效能評價 胸腹水中CEA、CA153、CYFRA211及Ki-67的四項檢測項目中敏感度最低的是CA153、特異性最低的是CYFRA211、陽性預測值最低的是CEA、陰性預測值最低的是CA153。見表8。

表8 單項待測的敏感性、特異性、準確度和陽性預測值、陰性預測值

2.5 聯合檢測胸腹水中CEA、CA153、CYFRA211及Ki-67的效能評價 將4項指標進行多種組合，以良性胸腹水組為對照組，分別計算兩兩組合、3項組合、4項組合的敏感性、特異性、陽性預測值及陰性預測值。試驗中只要有一個試驗呈現陽性即診斷為陽性。在兩項組合檢測中Ki-67和CYFRA211的敏感性最高，可達98.0%，但特異性最低，為67.6%。而Ki-67和CA153聯合檢測，特異性盡管最高，達76.4%，但敏感性卻最低，為88.3%。而在3項組合中，每種組合均可將敏感性提高到100.0%以上，但特異性卻比單項檢測或兩兩結合檢測的結果均低。見表9。

表9 聯合試驗檢測胸腹水中待測指標的敏感性、特異性、陽性預值、陰性預測值

3 討論

胸腹水在臨床上較常見，引起胸腹水的原因有多種，通過體格檢查和影像學檢查難以對其良性惡性進行有效地鑒別診斷。常規胸腹腔穿刺可以抽取胸腹水進行常規、生化、細胞學方面的檢查，但各有不足之處。這就迫切要求人們尋找一種有效地方法，來準確鑒別良、惡性胸腹水。

Ki-67即細胞核相關抗原（nuclear-associatedantigen, ki-67），其功能目前認為與細胞有絲分裂有關，其高表達是細胞增殖活躍的重要標記，檢測該抗原的表達有助于判斷腫瘤的生物學特性[1-2]。本實驗利于免疫細胞化學染色法檢測了51例惡性胸腹水和34例良性胸腹水的液基細胞涂片標本中Ki-67陽性表達情況。統計學處理表明：在惡性胸腹水和良性胸腹水的液基細胞涂片中，Ki-67的細胞表達數量差異有統計學意義（P<0.01），在進行Ki-67 AIOD定量測定中，惡性胸腹水相對含量明顯高于良性胸腹水，差異有統計學意義（P<0.01）。引起惡性胸腹水的絕大多數原因是腫瘤栓子種植于臟層胸膜、壁層胸膜或腫瘤胸腹膜轉移，故胸腹水中富含腫瘤或核異質細胞，導致Ki-67在異常增生的腫瘤細胞或核異質細胞中明顯表達，而正常的細胞中幾乎無或很少表達[3]。而在胸腹水中少數間皮細胞見弱表達，可能與腫瘤或炎性等因素的刺激下，間皮細胞增生活躍，導致Ki-67的表達增加。

雖然免疫細胞化學染色結果顯示多數惡性胸腹水中有Ki-67蛋白的表達，但仍有部分標本細胞中未見表達，從而使得Ki-67表達的敏感性只達到82.3%，特異性只有88.2%。可能原因有：由于Ki-67的表達具有細胞周期的依賴性，僅在細胞的G1后期出現，S、G2期升高，M期達峰值，G0期消失，如果腫瘤細胞處于細胞周期的G0期或G1的前期則無法檢測到Ki-67的表達。另外，常規檢測Ki-67表達所使用的標本多為組織切片，而本課題所使用的標本是通過TCT所制的脫落細胞學涂片，它的優勢在于可以使細胞分散，大細胞團少，背景干凈，減少了背景中的非特異性著色[4]，但劣勢在于標本在收集和處理時，可能存在細胞中的抗原丟失，導致無法檢測到Ki-67或表達較弱。所以為了提高診斷方法的敏感度、特異度及準確率，本實驗進行了免疫細胞化學染色與腫瘤標志物的聯合檢測。

腫瘤標志物（Tumor marker）是存在于細胞、體液或組織中的，由腫瘤自分泌產生或腫瘤與宿主機體相互作用產生的一類物質，反映了惡性腫瘤的產生和發展過程及癌基因的活化程度。本課題所選擇的3個腫瘤標志物包括CEA、CFYRA211、CA153。癌胚抗原（CEA）最初發現于成人結腸癌組織中，是一種結構復雜的可溶性糖蛋白。多數研究證實，細胞癌變時，相應染色體上的基因發生阻抑，致使原來被阻抑的基因在癌組織中重新活躍并產生CEA[5]。由于CEA的分子量大，在胸腔內形成的CEA不易進入血液循環，且未經肝臟代謝，因此惡性胸腔積液中CEA較高，出現也早。肺腺癌引起的胸腔積液中CEA升高最為明顯，CEA對良惡性胸腹腔積液的鑒別有一定價值，但CEA有時在一些正常人及良性腫瘤患者的血清中也有不同程度的升高，本研究中CEA的敏感性為72.6%，特異性為79.4%，比其它研究結果稍偏低。

細胞角蛋白19片段（CYFRAF21-1）是一種酸性多肽，主要分布在肺泡上皮。當這些細胞發生癌變時，可釋放CYFRA21-1進入血液循環，導致CYFRA21-1的血清水平升高。J.Niklinski等[6]研究顯示：CYFRA211對鱗癌的敏感性（76.5%）較腺癌（47.8%）和SCLC（42.1%）顯著增高（P<0.01,P<0.05）。它對非小細胞肺癌（NSCLC）的早期診斷、療效監測和預后判斷均有重要意義。我們對胸水中的CYFRA211進行檢測，結果顯示，惡性胸腹水中的水平較良性組明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。

CA153是一種由腺體分泌的粘蛋白，可以存在于多種腺癌內，如乳癌、卵巢癌、胰腺癌等，臨床上常用于乳癌及卵巢癌的檢測[7]。近年來對CA153在肺癌診斷中的作用已有報道，本研究顯示其在胸水中敏感度較低，僅為43.2%，而特異性較高，為88.2%。考慮可能因為相關研究的惡性胸腔積液包含多例乳腺癌轉移至胸膜病例，而本研究病例中乳腺癌的病例數較少，也可能對統計結果有一定影響，可做為一種聯合檢測指標。

本研究顯示單項腫瘤標志物的檢測有一定局限，為了克服單項檢測的不足，本研究組將細胞免疫組化聯合腫瘤標志物進行胸腹水的良、惡性質的判斷，經過對數據的統計分析顯示，在兩項組合檢測中Ki-67和CYFRA211的敏感性最高，但特異性最低。而Ki-67和CA153聯合檢測，特異性盡管高，但敏感性卻很低。而在3項組合中，每種組合均可將敏感性提高到90%以上，但特異性卻比單項檢測或兩兩結合檢測的結果均低，經對所有數據進行分析后，本研究組在Ki-67聯合腫瘤標志物檢測結果分析中發現Ki-67聯合CEA和CYFRA211的敏感性和特異性均不是最高，但敏感性可達98%，而特異性在所有檢測組合選擇中位于偏高水平，可達70.5%，這3項組合是我們所選擇的敏感性及特異性均理想的組合檢測。

本研究的結論表明細胞免疫組化Ki-67的表達聯合腫瘤標志物比單項檢測在鑒別良、惡性胸腹水上有更高的敏感性和較好的特異性。而在聯合檢測中，尤以Ki-67聯合CEA、CYFRA211檢測可將惡性胸腹水診斷的敏感性提高到98%，而特異性也可達到70.5%，從而成為在鑒別胸腹水良、惡性質中最大互補作用的檢測項目組合，進而使臨床減少漏診率和誤診率。

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Objective In this study, the choice of ki-67 monoclonal antibody marked pleural effusion and ascites’s cells smears by Thinlayer cytology test, and combining the quantitative analysis of joint CA153, CYFRA211 and CEA, such as three levels of tumor marker in pleural effusion and ascites, Comparative Effectiveness evaluation of combination of several different detection indicators to identify benign and malignant nature of pleural effusion and ascites. Methods In this study, samples were collected of 51 cases of malignant pleural and peritoneal effusions as the malignant group, and collected of 34 cases of benign pleural and peritoneal effusions as the benign group. Part of each samples Use immunohistochemical staining method to detect expression of Ki-67 in cells smears of malignant group and benign group by Thin-layer cytology test and semi-quantitative analysis. At the same time, the rest of the detection of tumor markers CA153, CYFRA211content CEA , Then each of the four indicators alone or in various combinations were detection effectiveness evaluation. Results Ki-67 expression and CYFRA 211, CEA levels In malignant group were higher than benign group, the difference was significant difference (P<0.05). In the evaluation of effectiveness, When four project testing pleural and peritoneal effusions alone, Sensitivity and negative predictive value is the lowest CA153, specificity is the lowest CYFRA211, positive predictive value is the lowest CEA. When pairwise combinations of the highest sensitivity in the detection is CYFRA211 and Ki-67, and up to 98.0%, but the specificity is low. Ki-67 and CA153 in specificity despite the highest, to 76.4%, but the sensitivity is lowest at 88.3%. In the three combinations, each combination may increase the sensitivity to 90.0%, but the specificity than single test or the results of pairwise binding assays were low. The sensitivity of the above four indicators together when combined detection of 100.0%, while specificity was detected in several ways to the lowest, to 44.1%. Conclusion Analysis of measured results, the expression of cell immunohistochemistry ki-67 Joint CEA, CYFRA211 detection sensitivity can be improved diagnosis of malignant pleural effusion to 98.0%, specificity can also be reached 70.5%, become the largest combination of complementary role in differentiating nature of benign pleural effusion and malignant.

Ki-67; Pleural effusion and ascites; Thin-layer cytology test; Immunohistochemical staining method; Tumor marker

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.6.001

包頭市社會發展科技支撐項目 （2011S2012-01-9）

內蒙古 014010 內蒙古包頭醫學院第一附屬醫院檢驗科 （王翠峰 任美英 付玉華 楊麗）