無創基因檢測在胎兒染色體非整倍體診斷中的應用

王利鋒 袁芳 樂濤 秦建波 何紅秋

無創基因檢測在胎兒染色體非整倍體診斷中的應用

王利鋒 袁芳 樂濤 秦建波 何紅秋

目的 評價無創基因檢測在胎兒染色體非整倍體診斷中的臨床應用價值。方法 選取253例高齡孕婦，在知情同意的原則下采集外周血血漿,對其血漿中胎兒游離DNA進行檢測；并與實驗孕婦的羊水染色體核型分析結果進行比對驗證。結果 本試驗對253例樣本進行了孕婦血漿胎兒游離DNA檢測，檢出21-三體陽性病例3例，檢出18-三體陽性病例1例，與染色體核型分析的結果一致。結論 無創基因檢測可以用于胎兒染色體拷貝數異常的檢測，具有無創、靈敏度高、特異性強等優點，在胎兒染色體拷貝數異常疾病的產前檢測中具有臨床實際應用的價值。

高齡孕婦；染色體非整倍體異常；胎兒游離DNA；無創產前診斷

染色體非整倍體異常是指染色體數目不是相應染色體組基數整倍數的狀態，其新生兒發病率約1‰～2‰。常以21、18、13-三體較為常見。其中以21-三體綜合征(又稱唐氏綜合征，Down’s syndrome或先天愚型)最為常見，新生兒發病率大約為1/600～1/800［1］。患兒通常都存在學習障礙、智能障礙或伴有臟器畸形等問題。目前對于該疾病的臨床檢測方法或假陽性比例較高，或存在一定的流產、致畸風險，這使得患者依從性較差［2］，導致許多21、18、13-三體等非整倍體患兒出生。

隨著孕婦外周血中胎兒游離DNA逐漸被學者們證實，利用胎兒游離DNA進行無創產前檢測越來越受到關注。該方法具有無創取樣、無流產風險、高靈敏度及準確性的特點［3］，可作為現有產前診斷技術的有益補充。在既往研究中，該方法常與唐氏血清學篩查方法進行比較，而與染色體核型分析方法進行比較的研究較少。本研究擬采用前瞻性研究策略，選取253例高齡孕婦，在早中孕期（孕13～26周）開展cff-DNA檢測，通過與臨床金標準技術-染色體核型分析進行比較，來對無創基因產前檢測技術的臨床應用價值進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象 收集2013年2月～2014年5月重慶渝中地區因高齡妊娠和產前篩查高風險等要求無創產前基因檢測的早、中孕期單胎孕婦253例，年齡35～46歲，孕周13～26周，平均（19.9±0.6）周。在知情同意的原則下采集孕婦靜脈血5mL，EDTA抗凝。

1.1.2 試劑與儀器 DNA提取試劑盒（天跟生化科技有限公司），T4多聚核苷酸激酶、Klenow DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶（德國Qiagen公司）；Ampure Beads試劑盒（美國BeckmanCoulter公司），2100 Bioanalyzer（美國Agilent公司），Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide Kit（Illumina公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取血漿DNA 將孕婦靜脈血于4℃、1600r/ min,離心10min，收集血漿后4℃、1600r/min，離心10min，取上層血漿，分裝，-80℃保存。以上操作在抽血后6h內完成。參照DNA提取試劑盒操作說明書提取血漿中的DNA。

1.2.2 高通量測序文庫制備 (1)T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶將獲得的DNA片段修復成平末端、加“A”、加接頭、PCR富集，最終獲得用于高通量測序的DNA文庫。(2)使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫質量進行分析，并使用real-time定量PCR對文庫進行精確定量。按照要求進行混合文庫（即Pooling）。

1.2.3 DNA測序 用Pooling后的文庫，經C-bot橋式反應擴增，在Illumina HiSeq平臺進行大規模基因并行測序，獲得約百萬條短DNA序列reads。經ELAND軟件將測序的數據與Ensemble數據庫的人類基因組參考序列進行比對，獲得已去重復序列的參考序列上唯一位置的21、18、13號染色體的數目。每個樣本原始數據不得少于5×106個序列數，比對后獲得的唯一序列不得少于2×106個序列數。結果判斷標準參照文獻［4］，每一母體血漿樣本中21、18、13號染色體序列數目與總的序列數目的比值。通過計算樣本待測染色體的比例與總體人群的比率之差，除以正常孕婦群染色體的標準方差，所得為Z值，若Z值大于或等于3，即認為待測樣本為三體高危；反之若小于或等于3，則為單體高危。

1.2.4 胎兒染色體核型確診方法 采集上述早、中孕期單胎孕婦253例孕婦的羊水，由醫院婦產科產前診斷中心經細胞培養后G顯帶，再使用Video Test-Karyo 3.1(美國)全自動染色體分析系統進行染色體核型分析。

2 結果

2.1 胎兒“21-三體綜合征”無創基因檢測 檢測出21-三體陽性樣本3例，陰性樣本250例。染色體核型分析結果檢測出21-三體陽性樣本3例，陰性樣本250例。與臨床金標準—核型分析相比，胎兒“21-三體綜合征”無創基因檢測的21-三體檢出率為100.00%，21-三體假陰性率為0.00%，21-三體假陽性率為0.00%，正確百分率為100.00%。見表1。

表1 21-三體兩種檢測方法的結果

2.2 胎兒“18-三體綜合征”無創基因檢 測檢測出18-三體陽性樣本1例，陰性樣本252例。染色體核型分析結果檢測出18-三體陽性樣本1例，陰性樣本252例。與臨床金標準—核型分析相比，胎兒“18-三體綜合征”無創基因檢測的18-三體檢出率為100.00%，18-三體假陰性率為0.00%，18-三體假陽性率為0.00%，正確百分率為100.00%。見表2。

表2 18-三體兩種檢測方法的結果

3 討論

無創產前遺傳學診斷是婦產科基礎研究和臨床工作的關注熱點。目前常用的產前篩查和診斷方法有：臨床上14～20孕周進行的“唐氏綜合征”血清學篩查、超聲NT篩查、羊水穿刺檢查、和臍帶血穿刺。血清學篩查法通過檢測孕婦外周血生化指標綜合計算出21-三體、18-三體及13-三體的發病概率，臨床上各種生化篩查方法的檢出率僅為66%～80%不等（包括二聯、三聯、四聯篩查），漏檢20%～34%不等，且假陽性率高［5］，每100個唐篩高危的患者，僅有不到1%是真正的唐氏兒；超聲檢查高度依賴于檢測設備分辨率和醫生個人經驗，難以形成統一的標準，且超聲檢查是對發育異常嚴重的畸變類型進行的診斷，對超聲指標不明確或有爭議的發育異常仍無法判斷。有創產前診斷技術（羊水穿刺檢查、臍血穿刺）準確率高，為臨床的金標準，但有創取樣有0.5%～2%的流產風險及1%左右的致畸風險［6］，且容易導致破水、羊膜腔炎、陰道出血、胎兒刺傷、呼吸窘迫等并發癥。其中文獻報道的羊水穿刺、胎兒臍帶血穿刺的流產率分別為0.5%和2%［7］。

與目前臨床常用的篩查和診斷方法相比，胎兒染色體非整倍體無創基因檢測技術具有早孕期檢測、無創取樣、無流產風險、高靈敏度以及高準確度的特點［8］，另外胎兒DNA在孕早期就可以檢測到，且分娩后很快被清除，不會受到前次妊娠的影響，且不影響再次妊娠［9］。因此，對孕婦外周血中胎兒游離DNA的檢測及其臨床應用研究將對無創性產前基因檢測技術的發展產生重大影響。

本研究共檢測253例樣本，檢測出21-三體陽性樣本3例，陰性樣本250例；18-三體陽性樣本1例，陰性樣本252例。與臨床金標準—核型分析結果相比，胎兒無創基因檢測的21-三體和18-三體檢出率為100.00%，假陰性率為0.00%，假陽性率為0.00%，正確百分率為100.00%。

從以上數據中可以看出，運用胎兒“21-三體綜合征”無創基因檢測篩查21、18-三體與臨床核型結果之間無統計學差異，符合臨床檢測要求，其敏感性、特異性與核型分析技術具有較高的一致性。本技術具有無創性、高準確性、高通量等優勢，具有臨床實際應用價值。建議針對高齡、高危孕婦，選取個體化的產前診斷策略，在早孕期充分利用cff-DNA檢測等新興高端技術，對胎兒染色體非整體異常做到早檢測、早診斷、早干預。至于在低危孕婦中的應用，以及能否徹底代替唐氏血清學篩查，則需要更多衛生經濟學方面的研究。

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Objective To validate the clinical value of noninvasive gene Detection in fetal chromosomal aneuploidy diagnosis. Methods A total of 235 pregnant women with advanced maternal ages were screened for maternal plasma cell-free fetal DNA (cff-DNA) examination, and the results were then confirmed by karyotype analysis. Results Of the 253 women examined, cff-DNA screening detected chromosomal aneuploidy in 4 cases, including trisome-21 in 3 cases, trisome-18 in 1 case as confirmed subsequently by karyotype analysis. Conclusion Noninvasive gene examination is efficient for detecting fetal chromosomal aneuploidies, and is non-invasive highly sensitive and specific. It therefore has a practical clinical value.

Advanced maternal age; Chromosomal aneuploidy; Cell-free fetal DNA; Non-vasive prenatal diagnosis

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.6.003

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