一測多評法測定保健食品中6種大豆異黃酮類成分

李麗敏，程益清，楊盈盈，毛秀紅，季申（上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203）

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一測多評法測定保健食品中6種大豆異黃酮類成分

李麗敏，程益清，楊盈盈，毛秀紅，季申
（上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203）

摘要：建立一測多評方法實(shí)現(xiàn)只用一個(gè)對照品同時(shí)測定保健食品中6種大豆異黃酮類成分的含量，以解決含大豆異黃酮類成分保健食品對照品昂貴不易獲得的難題。樣品經(jīng)甲醇超聲波輔助提取后，采用Waters XbridgeC18（150 mm× 4.6 mm，3.5μm）色譜柱，以2%乙酸和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，260nm并輔以DAD紫外檢測器檢測。通過5種待測成分與染料木苷的相對保留時(shí)間、DAD光譜及參照圖譜完成待測成分確認(rèn)；通過研究確立其他5種待測成分與染料木苷的校正系數(shù)進(jìn)行含量測定，一定線性范圍內(nèi)得到不同濃度對照品在不同儀器、人員及色譜柱上的校正系數(shù)RSD為0.4%～3.5%；3批不同來源保健食品中6種大豆異黃酮類成分測定結(jié)果與常規(guī)外標(biāo)法所得結(jié)果結(jié)果偏差為0.3%～5.8%；所建立的一測多評方法可用以大豆異黃酮及其相關(guān)保健食品的定量分析及質(zhì)量評價(jià)方法。

關(guān)鍵詞：一測多評；含量測定；高效液相色譜；大豆異黃酮；保健食品

大豆異黃酮（Soybean isoflavones，ISO）是從大豆中提取分離的一類具雌激素作用的活性成分，屬黃酮類化合物中異黃酮類成分［1-2］，具有抗癌、抑制生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧等功能，在癌癥預(yù)防、保護(hù)心血管系統(tǒng)、改善和預(yù)防婦女更年期綜合癥等方面具有獨(dú)特作用［3］，近年來在保健食品領(lǐng)域應(yīng)用較廣［4-5］。

大豆異黃酮包括染料木素、大豆黃素和黃豆黃素及其7-O-葡萄糖苷衍生物共12種［1］，用于保健食品原料的大豆異黃酮多含有大豆苷、黃豆黃素、染料木苷、大豆素、黃豆黃素苷元、染料木素6種成分，目前保健食品國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T23788-2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法高效液相色譜法》）中保健食品大豆異黃酮成分的檢測方法為高效液相色譜法測定上述6種成分［6］，但實(shí)際由于市場供應(yīng)的高純度標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴且不易獲得，同時(shí)測定6種成分時(shí)不僅提高檢測成本且降低檢測效率。有研究者曾采用對照品替代法測定6種大豆異黃酮類成分，但其待測成分確認(rèn)需采用質(zhì)譜方法，分析成本較高［7］。“一測多評”法（quantitative analysis of multi-components by singlemarker，QAMS）是近年來中藥領(lǐng)域用于多成分質(zhì)量控制的研究思路，它運(yùn)用同系列成分間存在的內(nèi)在函數(shù)比例關(guān)系，采用單個(gè)易獲得的對照品對多個(gè)成分進(jìn)行定量，實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分（對照品沒有或難以供應(yīng)）的同步監(jiān)控，目前已用于解決中藥質(zhì)量控制中缺乏對照品這一瓶頸問題［8-9］。

本研究以染料木苷對照品為參照，采用高效液相色譜與二極管陣列檢測技術(shù)，通過確定準(zhǔn)確的待測成分指認(rèn)參數(shù)和校正系數(shù)，建立了保健食品中大豆異黃酮類成分的一測多評測定方法，實(shí)現(xiàn)以一種對照品同時(shí)測定6種大豆異黃酮類成分，達(dá)到降低檢驗(yàn)成本、提高檢測效率的目的，可為含大豆異黃酮類保健食品的質(zhì)量控制提供技術(shù)方案。

1　儀器與試藥

Agilent 1100液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）：Merck公司；乙酸（分析純）：上海化學(xué)試劑有限公司。

大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆素、黃豆黃素苷元和染料木素等對照品均購自中國食品藥品檢定研究院、北京百靈威科技有限公司和上海同天生化生物科技有限公司。

收集3個(gè)不同來源的市售大豆異黃酮類保健食品（見表1），方法學(xué)驗(yàn)證均采用樣1作為研究對象。

表1　樣品來源及批號Table 1 The source and batch of samples

2　方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備

取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆素、黃豆黃素苷元、染料木素對照品適量，配置成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液用以方法學(xué)研究。

另取染料木苷適量，加甲醇制成每1mL含染料木苷20 μg/mL的對照品溶液，用于一測多評法含量測定。

2.2供試品溶液的制備

取供試品粉末約0.2g，精密稱定，置50mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲30 min使溶解，取出，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，離心，取上清液，作為供試品溶液。

2.3色譜條件與分析方法

色譜柱：Waters XbridgeC18色譜柱（150mm×4.6mm，3.5 μm，沃特世科技有限公司），柱溫：25℃，檢測波長260 nm；以乙腈為流動(dòng)相A，2%乙酸為流動(dòng)相B，按表2進(jìn)行梯度洗脫；分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5 μL進(jìn)樣分析。在此條件下，不同來源樣品中6種待測成分分離以及其與樣品中其他雜質(zhì)峰分離符合要求，見圖1。

表2　流動(dòng)相梯度洗脫表Table 2 The list of mobile phase gradient elution

圖1　保健食品中大豆異黃酮類分析色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ISO in health food

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察

分別吸取6種大豆異黃酮對照品混合溶液，配置系列濃度，按照既定方法進(jìn)樣分析，測定峰面積，以各成分的峰面積為縱坐標(biāo)，含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，在給定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表3。

表3　大豆異黃酮類成分線性關(guān)系及范圍Table 3 Regressive equation and liner of six ISOs

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn)

取樣1內(nèi)容物粉末0.2 g，一式6份，按照2.2項(xiàng)，分析平行操作6份樣品中各待測成分含量及其RSD，考察方法重復(fù)性。結(jié)果表明方法重復(fù)性較好。

2.4.3供試品溶液的穩(wěn)定性

取制備好的供試品溶液，分別于不同時(shí)間進(jìn)樣，比較一定放置時(shí)間內(nèi)各成分分面積變化，考察供試品溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果表明測定24 h內(nèi)6種大豆異黃酮類成分峰面積RSD小于1%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取樣1粉末0.1 g，精密稱定，一式9份，置50 mL量瓶中，分別按照樣品中含有的大豆異黃酮類成分的80%、100%、120%精密加入混合對照品，作為低、中、高3種濃度加樣回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度點(diǎn)各3份，按照

2.2項(xiàng)下分析，進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平的準(zhǔn)確度試驗(yàn)，結(jié)果表明見表4。

表4　方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The result of method validation

供試品中6種待測成分的加樣回收率均在95%～105%之間，方法準(zhǔn)確可靠。

2.4.5檢測限與定量限

取經(jīng)一定比例稀釋后混合對照品，進(jìn)樣，計(jì)算各色譜峰信噪比，以3倍和10信噪比時(shí)分別作為最低檢測限和最低定量限；再按照供試品含量計(jì)算公式分別計(jì)算得出方法最低檢出限及方法最低定量限（定容體積50 mL，稱樣量0.2 g），結(jié)果見表4。

2.4.6中間精密度

采用不同儀器、不同色譜柱，由不同人員按照擬訂的方法進(jìn)行試驗(yàn)，考察方法的中間精密度，評價(jià)方法耐用性，結(jié)果表明，既定條件下，方法耐用性較好。2.4.7一測多評方法研究

染料木苷對照品易獲得，且其出峰時(shí)間適中，故以染料木苷作為參照峰，以相對保留時(shí)間進(jìn)行其他色譜峰確認(rèn)，通過確定待測成分與染料木苷的校正系數(shù)，計(jì)算待測成分含量。

2.4.7.1相對保留時(shí)間及待測成分確認(rèn)研究

采用不同液相色譜及不同品牌色譜柱考察6種待測成分保留時(shí)間，以染料木苷為參照計(jì)算相對保留時(shí)間，結(jié)果見表5。

表5　相對保留時(shí)間結(jié)果Table 5 The result of relative retention time

待測成分的相對保留時(shí)間較穩(wěn)定，RSD均小于5%，以不同條件得到的平均相對保留時(shí)間，并設(shè)定10%的偏差范圍，可作為待測成分確認(rèn)指標(biāo)。

2.4.7.2校正系數(shù)的確定

分別由兩位分析人員對收集到的2個(gè)不同來源的6種大豆異黃酮對照品按照低、中、高濃度范圍的配置4組標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（每組n=6）；分別在不同儀器、不同色譜柱等條件下分析，得出各待測成分校正因子，計(jì)算其與染料木苷的校正系數(shù)。最終得到108個(gè)數(shù)據(jù)，采用依拉格法進(jìn)行可疑值的剔除，計(jì)算平均值（X）及樣本總體標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），以X±3SD為可信范圍，超出即為可疑值，予以剔除，結(jié)果表明108個(gè)數(shù)據(jù)中無可疑值，說明分析中得到的校正系數(shù)誤差較小，最終以平均值作為一測多評方法含量計(jì)算校正系數(shù)，見表6。

表6　校正系數(shù)測定結(jié)果Table 6 The result of the correction coefficient

2.4.7.3一測多評方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

3批樣品中按照確定的校正系數(shù)計(jì)算6種大豆異黃酮含量，并與常規(guī)對照品法進(jìn)行比較，驗(yàn)證一測多評校正系數(shù)準(zhǔn)確性，結(jié)果表明一測多評計(jì)算結(jié)果與對照品法接近，偏差小于6%，見表7。

表7　一測多評法與常規(guī)對照品法結(jié)果比較Table 7 Comparison of contents of ISO in health foods by two methods

3　討論

3.1一測多評方法研究的影響因素

一測多評方法應(yīng)用時(shí)通過與參照物的相對保留時(shí)間進(jìn)行待測成分指認(rèn)，保留時(shí)間受色譜柱、儀器等因素影響較大，因此建立方法時(shí)應(yīng)全面考察影響因素，并對保證方法耐用性的參數(shù)進(jìn)行明確［10］。

3.1.1相對保留時(shí)間及準(zhǔn)確待測成分指認(rèn)

考察了不同色譜柱及儀器，結(jié)果表明必需明確規(guī)定色譜柱填料、粒度、長度、粒徑等參數(shù)，才能保證既定條件下相對保留時(shí)間在一定范圍內(nèi)穩(wěn)定；研究中發(fā)現(xiàn)大豆苷與大豆黃苷、大豆素與大豆黃素的相對保留時(shí)間范圍交叉覆蓋，僅相對保留時(shí)間指標(biāo)難以精確指認(rèn)待測峰，因此需給出方法參照圖譜，以便給分析人員明確待測成分色譜峰出峰順序及其與雜質(zhì)峰分離情況，同時(shí)結(jié)合DAD光譜圖信息在245 nm～265 nm具有最大吸收峰的條件設(shè)置，可準(zhǔn)確確定待測成分。

3.2校正系數(shù)

待測成分校正系數(shù)需要大量全面的數(shù)據(jù)考察，對照品來源、純度、不同濃度、人員配置偏差等可能會(huì)帶來的誤差均會(huì)影響最終結(jié)果，進(jìn)而影響方法準(zhǔn)確性，同時(shí)儀器、色譜柱等因素也可能帶來一定偏差，因此研究中全面考慮各種因素可能帶來的誤差，考察了不同來源、不同濃度、不同人員、不同儀器和不同色譜柱的校正系數(shù)，得到較為全面的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確保方法耐用性和準(zhǔn)確性。

3.2一測多評方法應(yīng)用的實(shí)際意義

目前有關(guān)大豆異黃酮含量測定共均采用對照品外標(biāo)法測定測定6種大豆異黃酮類成分［6，11］，但大多數(shù)保健食品企業(yè)由于對照品昂貴、不易獲得，在企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中僅設(shè)定其中1種成分限量，個(gè)別企業(yè)最多也僅設(shè)定大豆苷、大豆素，染料木苷和染料木素4種成分；大豆異黃酮成分不同致使性質(zhì)有所差異，進(jìn)而其在體內(nèi)作用也會(huì)有所不同［12］，對照的不易獲得制約了產(chǎn)品質(zhì)量控制設(shè)定合理質(zhì)控指標(biāo)，一測多評方法的建立可為各生產(chǎn)企業(yè)在其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定大豆異黃酮類成分的含量限度提供方法依據(jù)，利于甄別產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)劣和進(jìn)行質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

［1］李小滿.大豆異黃酮分子結(jié)構(gòu)、生物活性及其市場現(xiàn)狀［J］.中國食品添加劑，2002（2）：66-71

［2］梅忠，孫健，孫愷，等.大豆異黃酮的保健功效、生物合成及種質(zhì)發(fā)掘與遺傳育種［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，2（7）：1208-1213

［3］郭小虎，代曉曼，張波.大豆異黃酮的生物活性劑毒理學(xué)研究進(jìn)展［J］.大豆科學(xué)，2011，30（4）：693-696

［4］宛超，徐海濱，劉珊，等.我國大豆異黃酮保健食品的概況分析［J］.華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，24（5）：30-33

［5］邵劍鋼，段奇，李曉莉.大豆異黃酮在軍用功能食品中的應(yīng)用［J］.食品研究與開發(fā)，2015，36（1）：145-147

［6］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì).GB/T 23788-2009保健食品中大豆異黃酮的測定方法高效液相色譜法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009：1-14

［7］魏鋒，李啟艷，馬玲云，等.對照品替代法同時(shí)測定中藥和保健食品中6種大豆異黃酮類成分的含量［J］.藥物分析雜志，2009，9 （5）：725-730

［8］王智民，高慧敏，付雪濤，等.“一測多評”法中藥質(zhì)量評價(jià)模式方法學(xué)研究［J］.中國中藥雜志，2006，31（23）：1925-1928

［9］羅祖良，仇峰，韋日偉，等.相對校正因子在中藥多指標(biāo)測定中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中草藥，2012，43（7）：1448-1452

［10］王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測多評法建立的技術(shù)指南［J］.中國中藥雜志，2011，36（6）：657-658

［11］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì).GB/T 26625-2011糧油檢驗(yàn)大豆異黃酮含量測定高效液相色譜法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011：1-9

［12］井樂剛，張永忠.大豆異黃酮及其在保健食品中的應(yīng)用［J］.生命的化學(xué)，2002，22（4）：379-381

A Quantitative Method Using One Marker for Simultaneous Assay of Soybean Isoflavones in Health Food

LI Li-min，CHENG Yi-qing，YANG Ying-ying，MAO Xiu-hong，JI Shen
（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract：A quantitative analysis method of multi-components with single marker（QAMS）was established and validated to simultaneously determine six Soybean isoflavones（ISO）in health foods，which can solve the dilemma of natural chemical reference substances are expensive and unavailable. The samples were ultrasonicassisted extracted with methanol，the column was Waters XbridgeC18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），using 2% acetic acid and acetonitrile as the mobile phase with gradient elution，260 nm and with DAD detection was used. The component to be measured were confirmed by DAD spectrum，reference chromatogram and the relative retention time of genistin. The relative correction factors（RCF）of the other five soybean isoflavones were determined within the linear ranges，the RCF had a good reproducibility in various instruments，chromatographic columns（RSD = 0.4%-3.5%）. According to their RCF，six ISO in health food could be quantified.The results of QAMS method were validated by comparing with that of external standard method by quantified three different sources of health food，and the relative average deviation of the two method were 0.3%-5.8%. The method can be used for the quantitative analysis and quality evalution for ISOs and its related health food.

Key words：quantitative analysis method of multi-components with single marker（QAMS）；assay；HPLC；soybean isoflavones（ISO）；health food

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.040

作者簡介：李麗敏（1975—），女（漢），副主任藥師，碩士，主要從事中藥及保健食品檢測方法及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

收稿日期：2015-03-10