茶氨酸對全腦缺血再灌注大鼠JNK信號通路與DNA修復的影響

王　寧， 呂建瑞， 張珍妮， 薛榮亮

(西安交通大學醫學院第二附屬醫院麻醉科,西安　710004；*通訊作者，E-mail：xuerl@china.com)

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茶氨酸對全腦缺血再灌注大鼠JNK信號通路與DNA修復的影響

王寧， 呂建瑞， 張珍妮， 薛榮亮*

(西安交通大學醫學院第二附屬醫院麻醉科,西安710004；*通訊作者，E-mail：xuerl@china.com)

摘要：目的探討茶氨酸在大鼠全腦缺血再灌注過程中對c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)信號通路與DNA修復的作用。方法15周齡雄性SD大鼠108只，隨機均分為假手術組(SH組)、缺血再灌注組(IR組)和茶氨酸組(TH組)。每組根據再灌注時間分為2，6，12，24，48，72 h 6個亞組，每亞組6只。采用4-VO法建立SD大鼠全腦缺血模型，在預定時間點行灌注固定取腦、石蠟包埋切片，光鏡下計數CA1區存活細胞，TUNEL法檢測CA1區凋亡細胞，免疫組化檢測p-JNK和DNA修復蛋白X線修復交叉互補蛋白1(X-ray repair cross complementing protein l,XRCC1)的表達變化。結果腦缺血再灌注后海馬CA1區神經元存活數目TH組明顯高于IR組(P<0.01)，凋亡細胞數目顯著低于IR組(P<0.01)。海馬CA1區p-JNK在IR組有明顯表達，24 h達到高峰；TH組p-JNK的表達明顯低于IR組(P<0.05)。SH組XRCC1表達量較強，IR組XRCC1的表達量下降(P<0.01)。TH組XRCC1表達量高于IR組(P<0.05)。 結論在大鼠全腦缺血再灌注損傷過程中，JNK信號通路與DNA修復蛋白XRCC1有一定關聯。JNK通路的激活在直接導致細胞損傷凋亡的同時，很可能也是DNA修復功能受傷的原因之一。茶氨酸則通過抑制JNK信號通路上調DNA修復蛋白XRCC1的表達發揮其神經保護作用。

關鍵詞：腦缺血再灌注損傷；茶氨酸；細胞凋亡；c-Jun氨基末端激酶；DNA修復蛋白

腦缺血卒中、心臟驟停等疾病嚴重危害著人類健康，腦缺血再灌注損傷是此類疾病的主要病理生理過程，探尋對腦缺血再灌注損傷有效的預防和治療的方法及藥物一直是臨床研究方向。近年來茶氨酸對神經損傷的保護作用受到了越來越多的關注[1]，但其對腦缺血再灌注損傷過程中的神經細胞凋亡和DNA修復功能的保護作用及機制目前尚不清楚。DNA修復蛋白X線修復交叉互補蛋白1(X-ray repair cross complementing protein l,XRCC1)是參與哺乳動物DNA的修復，在堿基切除修復中起整體作用，與DNA連接酶Ⅲ、DNA多聚酶β及PARA形成復合物修復一系列內外氧化劑導致的DNA單鏈斷裂和堿基損傷。腦缺血再灌注時，腦細胞氧供和能量代謝受到干擾，DNA的修復功能亦受到損傷，導致細胞凋亡[2]。在生物體內，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)超家族廣泛分布于細胞漿內，是細胞外與細胞內的信號轉導的交匯點。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNKs)是MAPK家族成員之一，被激活后迅速轉位入核，激活活化轉錄因子c-Jun、 AP-1、JunB、JunD、ATF-2、ELK-1等的轉錄活性，活化的轉錄因子與順式作用元件相結合，引起大量與凋亡有關的基因表達，與細胞延遲性死亡關系密切[3]。本實驗采用大鼠全腦缺血再灌注模型，應用組織病理學、TUNEL法凋亡細胞檢測、免疫組織化學等方法探討茶氨酸對JNK信號通路與DNA修復蛋白XRCC1表達的影響及相互關系。

1材料與方法

1.1主要實驗試劑

p-JNK抗體(購自美國Cell Signal公司)，XRCC1抗體(購自美國Santa Cruz公司)，原位末端細胞凋亡POD檢測試劑盒(購自中國華美公司)，DAB(購自北京中山試劑公司)，戊巴比妥鈉(購自西安)。DMSO(購自美國Santa Cruz公司)。

1.2動物分組

15周齡雄性SD大鼠，體重290-310 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。術前在20-25 ℃環境中飼養1周，術前夜禁食，隨意進水。隨機分為：假手術組(SH組)、缺血再灌注組(IR組)和茶氨酸組(TH組)。每組根據再灌注時間不同再分為2，6，12，24，48，72 h 6個亞組，每亞組6只動物。

1.3模型制作

采用4-VO法[4]建立SD大鼠全腦缺血再灌注損傷模型。1%戊巴比妥鈉40 mg/kg對大鼠腹腔注射施行麻醉(所有動物麻醉均與此相同)，仰臥位固定，頸前正中切口，分離雙側頸總動脈，穿線留置備用，縫合頸部切口。改俯臥位固定，頸后正中切口，逐層分離肌肉，暴露第一頸椎翼小孔，用燒紅的探針插入翼小孔，燒灼雙側椎動脈，使之永久閉塞。放回鼠籠。術后第2日，麻醉后仰臥位固定，剪開切口縫線，沿昨日留置線再次游離暴露雙側頸總動脈，予以微動脈夾夾閉6 min，松開微動脈夾恢復腦血流。頸總動脈夾閉2 min內瞳孔不散大者棄之。SH組僅游離暴露雙側頸總動脈，不予微動脈夾夾閉。三組動物在夾閉雙側頸總動脈前4 h分別尾靜脈注射0.9%NaCl,0.9%NaCl和25%茶氨酸(茶氨酸溶于0.9%NaCl)，4 ml/kg，藥物在5 min內注完。

1.4組織學觀察神經元形態及數目

在預定時間點，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg對大鼠腹腔注射施行麻醉，開胸，經升主動脈依次灌注0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)100 ml和4%多聚甲醛300 ml固定，取腦。取視交叉后1-4 mm腦塊進行石蠟包埋，冠狀面切片，切片厚5 μm。切片行HE染色，在400倍光鏡下計數CA1區中段100單位長度內存活神經元數目。

1.5TUNEL染色檢測凋亡細胞

取海馬冠狀石蠟切片，常規二甲苯、乙醇脫蠟至水。蛋白酶K(20 mg/L)室溫消化，用甲醇配制的3%過氧化氫消除內源性辣根過氧化酶活性，加末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT)與地高辛標記的dUTP混合反應進行孵育，再加辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體進行孵育，用DAB顯色，核呈深棕黃色者為凋亡細胞，最后復染、脫水、透明、封片。在400倍光鏡下計數海馬CA1區中段100單位長度內TUNEL染色陽性細胞數目。

1.6免疫組織化學檢測p-JNK和XRCC1表達水平

取海馬冠狀石蠟切片，采用SABC法行免疫組化法。p-JNK多抗及XRCC1多抗稀釋度分別為1∶100，1∶100。切片依次脫蠟至水，3%過氧化氫孵育10 min，三蒸水沖洗5 min。PBS(pH 7.4)浸泡5 min，電爐水浴抗原修復，加熱至95 ℃ 15-20 min后，自然冷卻至室溫。滴加正常山羊封閉血清，室溫孵育1 h，侵去勿洗。滴加1∶100的p-JNK多抗及1∶100的XRCC1多抗，放入4 ℃冰箱過夜。PBS沖洗5 min 3次，擦干切片周圍水分后，滴加生物素標記的二抗，37 ℃溫箱孵育1 h，PBS沖洗5 min 3次，擦干切片周圍水分后，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，放入37 ℃溫箱孵育20 min。三蒸水洗5 min 3次，DAB顯色，脫水、透明、封片。采用Leica Qwin圖像處理與分析系統進行圖像分析。每張切片取CA1區中1/3段測量平均灰度值代表p-JNK、XRCC1的表達水平，p-JNK、XRCC1的表達強弱與灰度值成反比。

1.7統計學分析

2結果

2.1海馬CA1區神經元形態及數目變化

SH組HE染色，海馬CA1區神經元細胞3-4層，排列緊密、整齊，細胞質呈淡紅色，細胞核呈藍黑色，高倍鏡下細胞核大而圓，有1-2個核仁；IR組HE染色，海馬CA1區神經元細胞失去正常結構，排列紊亂，細胞核皺縮或染色質邊聚，可見凋亡小體，細胞數量較SH組減少(P<0.01)；TH組海馬CA1區存活神經元細胞數目較IR組明顯增加(P<0.01，見表1)。再灌注2，6，12，24，48，72 h細胞計數IR組分別為SH組的97%，92%，89%，70%，52%，42%，而TH組再灌注24，48，72 h細胞計數分別為IR組的130%，167%和199%。

2.2海馬CA1區凋亡細胞變化

TUNEL法檢測，SH組凋亡細胞極少；IR組凋亡細胞于再灌注6 h開始增多， 24 h凋亡細胞數目明顯增加，48 h達到高峰；TH組凋亡細胞各時點較IR組明顯減少(P<0.01, 見表2)。

2.3海馬CA1區p-JNK和XRCC1免疫組化表達情況

SH組p-JNK表達量很低，IR組p-JNK的表達2 h時即明顯升高，6 h時略有降低，后逐漸上升，24 h到高峰，之后表達量減降，與SH組比較有顯著性差異(P<0.01)。TH組p-JNK的表達受到抑制，各時點與IR組比較均有顯著性差異(P<0.05, 見表3)。

組別n2h6h12h24h48h72hSH組634.18±8.2737.00±9.9633.07±7.9234.42±6.9535.70±6.7832.33±4.12IR組632.05±5.9734.18±6.76★29.06±3.54★24.10±7.65★18.22±4.78★13.28±8.28★TH組633.78±8.1635.67±4.9731.59±5.41▲31.22±7.46▲30.54±8.31▲26.53±6.48▲

與SH組相比，★P<0.01；與IR組相比，▲P<0.01

組別n2h6h12h24h48h72hSH組61.22±0.531.61±0.631.63±0.541.58±0.722.01±0.511.74±0.47IR組62.65±0.4916.41±3.18★25.77±5.91★56.54±4.84★48.42±7.16★31.59±4.92★TH組61.89±0.549.18±2.35▲14.00±1.89▲20.36±4.63▲16.69±2.76▲11.44±3.40▲

與SH組相比，★P<0.01；與IR組相比，▲P<0.01

組別n2h6h12h24h48h72hSH組6192.47±3.26193.39±3.62196.76±3.85194.59±5.03196.33±3.79189.71±6.35IR組6163.54±3.76★187.58±4.80★150.49±4.67★132.28±4.83★145.61±4.48★159.79±5.59★TH組6183.46±2.57▲182.59±5.39▲178.82±5.39▲170.18±3.26▲166.81±4.37▲165.89±4.95▲

與SH組相比，★P<0.01；與IR組相比，▲P<0.05

SH組XRCC1表達量較強，IR組XRCC1的表達與SH組比較有統計學差異(P<0.01)，2 h即已開始下降。TH組XRCC1表達量的降低則不明顯，各時點與IR組比較均有顯著性差異(P<0.05，見表4)。

3討論

XRCC1是編碼堿基損傷修復聯合序列的一種重要蛋白[5]，在堿基切除修復中起整體作用，腦缺血再灌注中大量DNA單鏈斷裂和細胞調亡相關，一過性局灶腦缺血10 min，XRCC1開始衰減，持續至再灌注后24 h[6]，免疫組化和TUNEL雙標顯示XRCC1免疫活性喪失的神經元變為TUNEL染色陽性，表明XRCC1早期降低先于DNA斷裂的發生[7]，XRCC1早期降低是DNA單鏈斷裂無法修復的機制之一[8]。本實驗采用大鼠全腦缺血再灌注模型，IR組XRCC1的表達隨再灌注時間亦呈衰減趨勢。JNK信號通路在細胞受到脅迫性刺激而發生凋亡的過程中發揮重要的作用。對其促調亡可能與上調促調亡蛋白的表達(p53、c-Myc、bax等)、作用于Bcl-2家族進而調控線粒體促進細胞色素酶的釋放[9,10]等有關。本實驗中IR組JNK的表達增加，凋亡細胞數目增多，再次證實了JNK的促凋亡作用。本課題組先前實驗中通過JNK信號通路抑制劑SP600125明顯抑制大鼠6 min全腦缺血后再灌注各時點JNK的表達，進而減輕了海馬CA1區神經元損傷，抑制了凋亡細胞的產生，與此同時，也明顯抑制了XRCC1在再灌注各時點的衰減，提示JNK可使全腦缺血再灌注大鼠海馬神經元DNA修復功能受損，導致細胞凋亡，其機制可能與下調DNA修復蛋白XRCCl的表達有關[11]。

組別n2h6h12h24h48h72hSH組697.76±4.6599.76±6.36108.19±5.32116.76±6.78113.35±5.63109.85±4.79IR組6126.77±5.57★142.07±5.65★153.60±6.53★166.38±6.81★182.66±4.95★174.45±6.29★TH組6117.45±6.09▲122.37±3.76▲126.39±4.48▲140.63±4.92▲157.64±5.96▲151.75±7.17▲

與SH組相比，★P<0.01；與IR組相比，▲P<0.01

茶氨酸是茶葉中的一種獨特成分，其作為食品添加劑已廣泛使用，具有良好的安全性、穩定性，且攝入量不受限制。目前越來越多的研究表明茶氨酸對神經系統有保護作用[12]，其可減小缺血再灌注之后的腦梗死面積[13]，其可同時作用于陽離子門控通道的離子型谷氨酸受體和G-蛋白偶聯的谷氨酸代謝型受體，直接拮抗谷氨酸對培養的神經細胞的興奮性毒性[14]，可抑制谷氨酰胺在神經元和星形膠質細胞之間的傳遞[15]，維持谷氨酸、谷氨酸鹽焦谷氨酸及γ-氨基丁酸的代謝平衡[16]，還有實驗證明其可提高幼鼠在神經發育成熟過程中神經營養因子和神經遞質的合成[17]，但具體機制尚未完全明確。在本實驗中，茶氨酸減輕了全腦缺血再灌注引起的海馬CA1區神經元損傷，抑制了凋亡細胞的產生。與此同時，茶氨酸明顯抑制了p-JNK在再灌注各時點的表達，并上調了XRCC1的表達，JNK與XRCC1的表達趨勢與我們前期實驗結果相一致。由此推論，在大鼠全腦缺血再灌注損傷過程中，茶氨酸可能作用于JNK信號通路抑制JNK信號通路的激活，減少XRCC1的下調，維持并促進DNA修復功能，進而抑制神經元凋亡和損傷來發揮其神經保護作用的。

綜上所述，茶氨酸對全腦缺血再灌注海馬CA1區神經元損傷及凋亡具有保護作用，抑制JNK凋亡通路并維持DNA修復功能可能是其機制之一，為茶氨酸作為神經保護劑的潛在研發工作提供了一定的理論依據。

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Effect of theanine on JNK signaling pathway and DNA repair in global brain ischemia/reperfusion rats

WANG Ning, Lü Jianrui, ZHANG Zhenni, XUE Rongliang*

(DepartmentofAnesthesiology,SecondAffiliatedHospitalofMedicalCollege,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;*Correspondingauthor,E-mail:xuerl@china.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of theanine on c-Jun N-terminal kinase(JNK) signaling pathway and DNA repair in global brain ischemia/reperfusion rats.MethodsOne hundred and eight 15-week-old SD rats were randomly divided into sham operation group, ischemia-reperfusion(IR) group and theanine group. Each group was divided into 6 subgroups according to reperfusion time: 2, 6, 12, 24, 48, 72 h groups.Transient global brain ischemia was induced by four-vessel occlusion, and the rats were perfusion-fixed at specified time points after reperfusion. The brains were removed, embedded and sliced up. The numbers of survival cells and apoptotic cells in hippocampal CA1 region were counted respectively by histochemistry and TUNEL,and the activities of p-JNK and X-ray repair cross complementing protein l(XRCC1) were detected by immunohistochemistry.ResultsIn theanine group, the number of survival cells in hippocampal CA1 region was significantly higher than that in IR group(P<0.01), and the number of apoptotic cells was lower than that in IR group(P<0.01). The p-JNK in IR group was markedly expressed in CA1 region, and the expression reached the peak at 24 h after reperfusion. The level of p-JNK in theanine group was significantly lower than that in IR group(P<0.05). The XRCC1 was markedly expressed in sham group, whereas the expression decreased in IR group(P<0.01), and the level of XRCC1 in theanine group was higher than that in IR group(P<0.05).ConclusionThere is a certain relationship between JNK signaling pathway and DNA repair protein XRCC1 during global brain ischemia-reperfusion injury. The activation of the JNK signaling pathway may be one of the reasons of the damages of DNA repair protein function during the induction of cell apoptosis. Theanine may play its neuroprotection by inhibiting JNK signaling pathway and up-regulating the expression of DNA repair protein XRCC1.

Key words:brain ischemia/reperfusion injury;theanine；apoptosis;JNK;DNA repair protein

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81071070)

作者簡介：王寧，女，1983-04生，碩士，主治醫師，E-mail：wangningcare@163.com

收稿日期：2016-02-25

中圖分類號：R363

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)05-0415-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.004