益氣復脈方對慢性心衰大鼠基質金屬蛋白酶活性調節作用的實驗研究

張秋月，王保和，劉偉爽，鄧雅芳

1.天津中醫藥大學(天津 300193)； 2.天津中醫藥大學第二附屬醫院

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益氣復脈方對慢性心衰大鼠基質金屬蛋白酶活性調節作用的實驗研究

張秋月1，王保和2，劉偉爽1，鄧雅芳1

1.天津中醫藥大學(天津 300193)； 2.天津中醫藥大學第二附屬醫院

摘要：目的觀察注射用益氣復脈方(凍干)(YQFM)對慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌基質金屬蛋白酶(MMPs)及其組織抑制因子(TIMPs)蛋白表達的影響，探討益氣復脈方對基質金屬蛋白酶系統的調節作用與心肌細胞外基質(EMC)重構的相關性。 方法100只雄性wistar大鼠中隨機選取90只通過腹主動脈縮窄法制作大鼠慢性心力衰竭模型，10只作為假手術組常規飼養。術后8 w，以多普勒超聲心動圖檢測左室射血分數(LVEF)≤60%為成模標志。成模大鼠隨機分為6組：空白模型組、卡托普利組(卡托普利片4.88 mg/kg)、生脈組(生脈注射液4 mL/kg)及益氣復脈中、低、高(520 mg/kg，260 mg/kg，1040 mg/kg)劑量組。連續給藥14 d后，以HE染色法觀察大鼠心肌組織病理變化以蛋白質印記法檢測大鼠心肌組織中MMP-2，MMP-3，MMP-9以及TIMP-1，TIMP-2的含量。結果與假手術組比較，空白模型組心肌間質膠原纖維大量增生，EMC結構顯著改變，可見局灶性纖維瘢痕；MMP-2、MMP-3、MMP-9含量顯著升高(P<0.01)，TIMP-1/2含量顯著降低(P<0.01)，MMP-2/TIMP-2比值升高為假手術組的4倍～6倍。與空白模型組比較，各治療組心肌肌束間及血管周圍膠原纖維出現輕、中度增生，MMP-2、MMP-3、MMP-9降低，TIMP-1/2升高，MMP-2/TIMP-2比值降低為假手術組的1～3倍。其中，YQFM各劑量組MMP-2、MMP-3、MMP-9含量顯著低于生脈組(P<0.05)，除YQFM低劑量組MMP-2顯著高于卡托普利組(P<0.05)外，其余各YQFM組MMP-2、MMP-3、MMP-9含量與卡托普利組比較差異無統計學意義(P>0.05)。YQFM各劑量組TIMP-2含量顯著高于生脈組(P<0.05)，與卡托普利組比較差異無統計學意義(P>0.05)；YQFM各劑量組TIMP-1含量與MMP-2/TIMP-2比值顯著低于卡托普利組(P<0.05)，與生脈組比較差異無統計學意義(P>0.05)；結論慢性心衰大鼠心肌間質膠原纖維增生、膠原網絡結構改變導致EMC重構，與基質金屬蛋白酶系統活性增強有關。益氣復脈方通過降低MMP-2，MMP-3，MMP-9的含量，升高TIMP-1，TIMP-2的含量，維持 MMP-2/TIMP-2動態平衡，抑制MMPs活性，改善慢性心衰大鼠心肌細胞外基質重構的程度，緩解大鼠慢性心衰癥狀。

關鍵詞：慢性心衰；基質金屬蛋白酶；組織抑制因子；益氣復脈方；蛋白質印跡法

心肌細胞外基質(extracellular matrix， EMC)的重構是多種因素引起基質膠原增生、膠原網結構改變的過程，是慢性心力衰竭心室重構發生發展的重要環節。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMPs)及其組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase， TIMPs)在EMC降解和膠原網絡重構過程中起重要作用。本研究觀察益氣復脈方(YQFM)對慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)大鼠心肌組織中MMP-2， MMP-3， MMP-9及TIMP-1，TIMP-2蛋白表達的影響，探討益氣復脈方對MMPs系統的調節作用與EMC重構的相關性。

1材料與方法

1.1動物100只清潔級雄性Wistar大鼠，體重220 g～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[合格證號：SCXK(京)2009-0004]。每籠5只，適應性飼養1周后進行實驗。

1.2藥品與試劑注射用益氣復脈(凍干)，每瓶裝0.65 g(相當于紅參0.5 g，五味子0.75 g，麥冬1.5 g)，天津天士力之驕藥業有限公司生產(批準文號：國藥準字Z20060463；產品批號：20130805)。卡托普利片，每片12.5 mg，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(批準文號：國藥準字H31022986；產品批號：1402032)。生脈注射液，每支25 mL，江蘇蘇中藥業集團股份有限公司(批準文號：國藥準字Z20053993；產品批號：13070803)；MMP-2，MMP-3，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2抗體(Abcam公司，美國)由天津易生源生物技術有限公司提供。

1.3實驗儀器5418R低溫離心機、高速離心機(Eppendorf公司，德國)，BSA124S-CW電子天平(Sartorius公司，德國)，移液槍(Eppendorf公司，法國)，微量加樣吸頭(北京中衫金橋生物有限公司)，PVDF膜(Millipore公司，美國)，醫用X射線膠片(柯達公司，美國)，通用顯影粉、酸性定影粉(天津天陸海感光材料廠)，電泳儀、凝膠玻璃板、固定夾、DYCZ-20C垂直電泳槽、DYCP-40C轉移槽(北京六一儀器廠)，TS-8轉移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司)。

1.4造模100只大鼠中隨機選取90只，依據文獻采用腹主動脈縮窄法制備大鼠慢性心力衰竭模型[1]。術后8周，以多普勒超聲心動圖檢測左室射血分數(LVEF)≤60%，同時大鼠出現體重減輕、精神萎靡、毛色無光澤作為心衰模型成功的標志納入心衰模型組。余10只為假手術組，腹主動脈只穿線不結扎，常規飼養12周。

1.5分組給藥將成模大鼠隨機分為6組：①空白模型組不進行藥物干預，常規飼養；②卡托普利組：1.56 mg/mL的卡托普利懸濁液，4.88 mg/kg，每日灌胃；③生脈組：生脈注射液4 mL/kg，尾靜脈注射；④益氣復脈中劑量組(YQFM-M)：注射用益氣復脈(凍干)0.65 g溶于4 mL生理鹽水，520 mg/kg，尾靜脈注射；⑤益氣復脈低劑量組(YQFM-L)：0.65 g藥物溶于8 mL生理鹽水，濃度為中劑量組的0.5倍，260 mg/kg 尾靜脈注射；⑥益氣復脈高劑量組(YQFM-H)：0.65 g藥物溶于2 mL生理鹽水，為中劑量組2倍濃度，1 040 mg/kg 尾靜脈注射。

1.6HE染色法觀察大鼠心肌病理改變連續給藥14 d后，處死大鼠，取出心臟，于左心室中部沿橫軸切取0.5 cm厚的心肌組織用4%多聚甲醛溶液固定，剩余心尖部迅速置于凍存管內，液氮保存用于蛋白質印跡檢測。固定后的心肌組織常規石蠟包埋，制成4 μm～6 μm切片，脫蠟后HE染色，100倍鏡下觀察大鼠心肌組織病理變化。

1.7蛋白質印跡法檢測大鼠心肌組織中MMPs，TIMPs含量以Western blot法對心肌組織內MMP-2，MMP-3，MMP-9以及TIMP-1，TIMP-2進行半定量檢測。 收集大鼠心肌的培養細胞充分裂解后，以考馬斯亮藍法測定各細胞樣本相應目的蛋白含量，提取總蛋白-80 ℃保存。將樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后將凝膠上分離到的蛋白條帶用半干轉的方式轉印至PVDF膜上。分別用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測。曝光及洗片后用image J軟件分析灰度值，并以各目的蛋白與內參β-actin灰度值的比值， 計算相對灰度值，表示目的蛋白的含量。

2結果

2.1大鼠一般情況術后8 w，模型組大鼠較假手術組大鼠出現：體重減輕、食量減少、精神萎靡、活動度降低；皮毛干枯欠順滑、毛色暗黃無光澤，備皮部位毛發生長緩慢、稀疏；四肢及尾部皮色淡白，尾靜脈充盈較差，血管纖細，顏色黯淡。給藥14 d后，各治療組大鼠活動度明顯增強、皮毛光澤度增加；益氣復脈中/高劑量組大鼠四肢及尾部色澤紅潤，尾靜脈充盈度較好，明顯優于其他治療組。

2.2心肌組織 HE染色結果病理結果顯示：術后10周，假手術組大鼠心臟結構清晰，形態正常，心肌肌束間散在少量膠原纖維，心肌細胞排列規整(見圖A)。空白模型組心肌肌束間及血管周圍膠原纖維顯著增生，可見灶性纖維瘢痕，心肌細胞萎縮或壞死，排列紊亂，間質血管擴張充血，ECM重度重構(見圖B)。卡托普利組心肌細胞排列規整，形態正常，偶見心肌肌束間及血管周圍膠原纖維增生，ECM重構不明顯(見圖C)；YQFM中/高劑量組心肌肌束間及血管周圍膠原纖維輕度增生，偶見心肌細胞萎縮，心肌細胞排列規整，出現輕度ECM重構見圖E/G；生脈組/YQFM低劑量組 心肌肌束間及血管周圍膠原纖維輕、中度增生，間質血管輕度擴張充血，偶見灶性區中度增生，局部心肌細胞萎縮，排列稍紊亂， ECM中度重構(見圖D/F)。

注：A為假手術組 B為空白模型組 C為卡托普利組 D為生脈組 E/F/G為益氣復脈中/低/高劑量組

圖1各組大鼠心肌HE染色圖片(×100)

2.3心肌組織MMPs，TIMPs含量比較

2.3.1MMP-2，MMP-3，MMP-9相對灰度值比較與假手術組比較，空白模型組MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值差異有統計學意義(P<0.01)。卡托普利組MMP-2，MMP-9灰度值與假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)，生脈組MMP-2，MMP-9灰度值與空白模型組比較無統計學意義(P>0.05)，其余各治療組MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值均顯著低于空白模型組(P<0.01，P<0.05)，顯著高于假手術組(P<0.05，P<0.01)。其中，YQFM各劑量組MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值顯著低于與生脈組(P<0.05)；除YQFM低劑量組MMP-2灰度值顯著高于卡托普利組(P<0.05)外，其余各YQFM組MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值與卡托普利組比較無統計學意義(P>0.05)。見表1，詳見圖2。

表1　大鼠心肌組織MMP-2，MMP-3，MMP-9相對灰度值比較(±s)

2.3.2TIMP-1/2相對灰度值比較空白模型組大鼠TIMP-1/2灰度值顯著低于假手術組(P<0.01)，給藥各組TIMP-1/2灰度值較空白模型組顯著上升(P<0.01或P<0.05)。其中，卡托普利組TIMP-1灰度值明顯高于生脈組及益氣復脈各劑量組(P<0.05)，與假手術組比較無統計學意義(P>0.05)。YQFM各劑量組TIMP-2灰度值顯著高于生脈組(P<0.05)，與卡托普利組比較無統計學意義(P>0.05)。詳見表2、圖2。

表2　大鼠心肌組織TIMP-1，TIMP-2，MMP-2/TIMP-2相對灰度值比較(±s)

2.3.3MMP-2/TIMP-2含量比值空白模型組大鼠MMP-2/TIMP-2比值顯著升高，達到假手術組的4倍～6倍(P<0.01)。與空白模型組比較，給藥各組MMP-2/TIMP-2比值顯著下降(P<0.01)，為假手術組的1倍～3倍；YQFM各劑量組與生脈組差異不明顯(P>0.05)，卡托普利組MMP-2/TIMP-2比值<1，顯著低于其他給藥組(P<0.05)。詳見表2。

注：A為假手術組 B為空白模型組 C為卡托普利組D為生脈組 E/F/G為益氣復脈中/低/高劑量組。

圖2各組大鼠MMPs，TIMPs蛋白含量條帶圖

3討論

在CHF進展過程中，EMC合成與降解失衡，使心肌細胞間質蛋白結構與成分發生改變，從而導致心肌組織形態、結構功能的異常。存在于心肌中的MMPs活性的增強是心室重構的始動因素[2]。其中，明膠酶(MMP-2和MMP-9)、基質分解素(MMP-3) 可分解多數ECM成分；MMP-3的活性早期升高有利于其它MMPs的激活[3]。因此，MMP-2、MMP-3、MMP-9是心肌細胞外基質重構時主要的酶。TIMPs是MMPs特異性內源抑制因子，TIMPs與MMPs以1∶1(摩爾比)的比例結合形成的MMP-TIMP復合體的形式，抑制MMPs的活性。TIMP -1主要抑制MMP -1、MMP -3和MMP -9；TIMP -2主要抑制MMP -2，并只隨MMP -2表達而表達。通過競爭性結合，TIMPs可以阻斷活化的MMPs與膠原結合，進而減少基質降解[4]。MMPs/TIMPs的動態平衡是維持心肌膠原纖維及心臟結構正常的重要因素。研究表明，隨著MMPs活性升高，TIMPs是降低的[5]。在心肌病晚期，心肌內MMPs活性升高，與TIMPs對MMPs的抑制作用喪失有關；減少MMPs-TIMPs復合物水平可使MMPs活性升高[6]。

本研究結果顯示，CHF大鼠心肌細胞外基質發生病理學改變：正常形態的膠原網絡降解，異常結構的膠原大量增生沉積，形成灶性纖維瘢痕，引發EMC重構。這與CHF大鼠心肌MMP-2，MMP-3，MMP-9含量增加、活性增強，TIMP-1，TIMP-2含量下降、對MMPs抑制作用減弱，MMP-2/TIMP-2比值顯著升高有關。經藥物治療后，各組MMPs含量下降，TIMPs含量升高。益氣復脈(凍干)對MMP-2，MMP-3，MMP-9的降低作用與對TIMP-2的升高作用與卡托普利等效，均優于生脈注射液；益氣復脈(凍干)對TIMP-1的升高作用與對MMP-2 /TIMP-2比值的降低作用不及卡托普利，與生脈注射液無差異。

中醫學將慢性心衰歸為“心悸”“怔仲”“水腫”“咳喘”“痰飲”“心痹”等病癥的范疇。心氣不足、氣陰兩虛乃至心陽虛衰、本虛標實為其主要的證候演變規律。益氣復脈方來源于張元素所著《醫學啟源》中的名方生脈散，謂之“人有將死脈絕者，服此能復生之，其功甚大”。生脈注射液是生脈散經現代方法提取紅參、麥冬、五味子的有效成分制成，具有益氣養陰、復脈固脫之效。該制劑可提高心肌收縮力、增強心臟泵血，且毒性小、安全度大[7]，為改善心功能、緩解心衰癥狀的常用藥物。注射用益氣復脈(凍干)是目前唯一的凍干粉劑型的益氣復脈劑，采用冷凍干燥技術提取，95%以上的明確成分可通過指紋圖譜得到體現，較傳統水針劑更加穩定、質量更可控[8]。

本研究中模型組大鼠在術后8周出現明顯的慢性心衰體征：體重減輕、精神萎靡、活動度下降、四肢及尾部微循環障礙。給藥后大鼠心衰癥狀明顯緩解，活動度增強；而中/高劑量的益氣復脈(凍干)對心衰大鼠皮膚、四肢、尾靜脈循環狀態的改善作用明顯優于卡托普利、生脈注射液及低劑量益氣復脈(凍干)。有關模型動物中醫證型規范化標準化的研究證明：睡眠剝奪后引起大鼠左室功能的降低，與氣陰兩虛時，血運無力相吻合[9]。

慢性心衰大鼠心功能降低，出現氣陰兩虛證候時，益氣復脈方對大鼠循環障礙癥狀的緩解作用，既是其益氣養陰、益心復脈功效的體現。這可能與益氣復脈方能降低MMP-2，MMP-3，MMP-9的含量，升高TIMP-1，TIMP-2的含量，維持 MMP-2/TIMP-2動態平衡，抑制了基質金屬蛋白酶的活性，改善慢性心衰大鼠心室重構的作用有關。

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(本文編輯 薛妮)

Regulative Effects of Yiqifumai Injection on the Activity of Matrix Metalloproteinase in Rats with Chronic Heart Failure

Zhang Qiuyue，Wang Baohe，Liu Weishuang，Deng Yafang

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China

Abstract：Objective To investigate the regulative effect of Yiqi Fumai injection(YFI) on the activity of matrix metalloproteinase (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMPs) in rats with chronic heart failure(CHF)，and explore the regulation of YFI on MMPs and its correlation with the reconstruction of myocardial extracellular matrix(EMC).MethodsOne hundred Wistar rats were randomly divided into sham group (n=10) and model group(n=90).The CHF rat model was established by abdominal aortic banding.After 8 weeks of operation， rats were divided into 6 groups：blank model group， captopril group，Shengmai injection(SMI) group， YFI groups(high-，medium-，low-dosage).After 14 days， the myocardial pathological changes were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9，TIMP-1 and TIMP-2 in myocardial tissue were detected by western blotting.ResultsCompared with sham group， myocardial interstitial collagen fibers proliferated， EMC structure changed，focal fibrous scars were visible in blank model group.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9 and MMP-2/TIMP-2 ratio increased while the contents of TIMP-1 and TIMP-2 decreased in blank model group.Compared with blank model group group，the light and moderate proliferation of collagen fibers appeared around myocardial muscle bundle and vessels in captopril group， SMI group， YFI groups.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9 and MMP-2/TIMP-2 ratio decreased while the contents of TIMP-1 and TIMP-2 increased in captopril group， SMI group， YFI groups.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9 in YFI groups were lower than that in SMI group(P<0.05).The content of MMP-2 in YFI low-dosage group was higher than that in captopril group(P<0.05).The contents of TIMP-2 in YFI groups were higher than that in SMI group(P<0.05).The content of TIMP-1 and MMP-2/TIMP-2 ratio in YFI groups were lower than that in captopril group(P<0.05).ConclusionThe myocardial interstitial collagen proliferation and collagen structure changes induce the reconstruction of EMC in rats with CHF， which is relevant to the enhancement of MMPs activity.YFI can inhibit MMPs activity and improve myocardial EMC remodeling by by lowering the content of MMP-2，MMP-3，MMP-9， increasing the content of TIMP-1，TIMP-2， maintaining MMP-2/TIMP-2 homeostasis in rats with CHF.

Key words：chronic heart failure； matrix metalloproteinase；tissue inhibitor of metalloproteinase；Yiqi Fumai injection；western blotting

基金項目：國家自然基金項目(No.81173241)

通訊作者：王保和，E-mail： wbh3423@sina.com

中圖分類號：R541.6R289.5

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．08．009

文章編號：1672-1349(2016)08-0825-05

Corresponding Author：Wang Baohe (The Affiliated Second Hosipital，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin，China)

(收稿日期：2015-08-11)

·基礎醫學論著/研究·