血管緊張素(1-7)對氧化低密度脂蛋白誘導大鼠主動脈內皮細胞損傷的作用機制

杜寧輝，楊志明，楊慧宇

山西醫科大學附屬第二臨床醫學院(太原 030001)

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血管緊張素(1-7)對氧化低密度脂蛋白誘導大鼠主動脈內皮細胞損傷的作用機制

杜寧輝，楊志明，楊慧宇

山西醫科大學附屬第二臨床醫學院(太原 030001)

摘要：目的觀察血管緊張素(1-7)[Ang(1-7)]對氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的大鼠主動脈內皮細胞(SVAREC)血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1(LOX-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)表達水平的影響，探討其可能作用機制。方法將大鼠隨機分為ox-LDL組和ox-LDL+Ang(1-7)組。實驗通過Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)檢測細胞增殖情況。通過熒光實時定量PCR法檢測LOX-1、VCAM-1、ICAM-1mRNA的表達水平。結果ox-LDL可以抑制SVAREC細胞的增殖，并呈劑量依賴性，與對照組比較有統計學意義(P<0.05)。ox-LDL+Ang(1-7)組可以使SVAREC細胞生長抑制率降低，并呈劑量依賴性，與對照組比較有統計學意義(P<0.05)。隨著ox-LDL濃度的升高，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1 mRNA表達量上升，并呈劑量依賴性，與對照組比較有統計學意義(P<0.05)，加入Ang(1-7)，隨著Ang(1-7)的濃度升高，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA表達量下降。結論ox-LDL可以損傷SVAREC細胞，并使LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA表達量上升，Ang(1-7)抑制ox-LDL的上述反應，并且可能通過LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA發揮作用。

關鍵詞：血管緊張素 (1-7)；氧化低密度脂蛋白；氧化低密度脂蛋白受體1；主動脈內皮細胞；血管細胞黏附分子-1；細胞間黏附分子-1

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是許多心血管疾病的病理基礎，目前公認血管內皮細胞的損傷和功能障礙是AS發生和發展的始動因素和中心環節之一。血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1(lectin like oxidized low-density lipoprotein receptor 1，LOX-1)是近年發現的新型氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)特異受體，是內皮細胞攝取和代謝ox-LDL的主要受體，其介導血管內皮細胞攝取ox-LDL并引起內皮損傷及功能改變[1-2]。血管緊張素(1-7)[Ang(1-7)]具有降血壓，保護心肌細胞等作用[3]。細胞間黏附分子-1(ICAM-1)又稱 CD54，是目前已知的最廣泛的細胞間黏附分子，正常情況下它呈現低表達狀態，某些炎癥刺激后其表達明顯增加。ICAM-1廣泛分布于血管內皮細胞、樹突狀細胞、各類上皮細胞、激活的淋巴細胞、巨噬細胞和纖維母細胞等表面，不但參與炎癥反應、誘導新生血管生成、免疫反應，而且與動脈粥樣硬化的形成等有關[4]。血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)是免疫球蛋白超基因家族，主要由血管內皮組胞表達，在高血脂刺激AS形成過程中，能促進免疫細胞浸潤，使單核細胞和淋巴細胞黏附于血管內皮[5]。本實驗觀察Ang(1-7)對ox-LDL誘導大鼠主動脈內皮細胞(SVAREC)LOX-1、ICAM-1、VCAM-1的表達水平的影響，探討其可能作用機制。

1材料與方法

1.1材料與試劑大鼠主動脈內皮細胞SVAREC(上海滬震生物科技公司)；Ang(1-7)、ox-LDL購自美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；DMEM培養液為美國Gibco公司產品；CCK-8為美國Sigma公司產品；TrizolRNA提取試劑、反轉錄試劑盒、FastStart Universal SYBR Green Mastel(ROX)試劑盒均為羅氏公司產品；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；酶標儀為美國Becton Dickinson公司產品。

1.2大鼠內皮細胞的培養大鼠內皮細胞SVAREC懸浮于含20%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養基中，置于體積分數5% CO2培養箱中37 ℃保存，用0.25%胰蛋白酶進行消化、傳代。取2代～3代細胞進行試驗，給予干預措施時培養液改為含3%胎牛血清的DMEM。

1.3實驗分組① ox-LDL組，分為空白對照組及實驗組(ox-LDL濃度分別為10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)；②ox-LDL+Ang(1-7)組，分為對照組(ox-LDL終濃度為100 mg/L)及實驗組[(Ang(1-7)濃度分別為10-9mol/L～10-6mol/L)]。

1.4CCK-8法檢測大鼠細胞增殖情況收集2代～3代SVAREC細胞處于對數生長期的細胞消化、重懸、計數，以5×104/mL密度每孔100 μL，接種細胞至96孔板。對照孔加入不含藥物的新鮮培養液100 μL，給藥組每孔加入不同濃度的含藥培養液100 μL，設5個復孔，于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養24 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，于CO2培養箱中孵育1 h后，用酶標儀于450 nm波長下測定吸光度值，采用雙波長進行測定吸光度值(A值)。按照公式計算細胞的生長抑制率，上述實驗重復3次后取平均值，用SPSS17.0軟件計算。 細胞生長抑制率=(1-實驗組的平均A值/陰性對照組的平均A值)×100%

1.5實時定量PCR檢測LOX-1、ICAM-1、VCAM-1 mRNA收集經ox-LDL組、ox-LDL+Ang(1-7)組處理24 h的細胞，用TRIzol試劑提取總RNA，采用紫外可見光分光光度計測定260 nm/280 nm OD值，測定RNA純度。以Ol-igo dT為引物，按照逆轉錄試劑盒說明書進行操作，得到對應的cDNA，置于-20 ℃保存備用。以cDNA為模板LOX-1、ICAM-1、

VCAM-1引物進行擴增，用GAPDH做內參照。LOX-1上游引物5′-ACCACCAGAATCTGAATCTCCAA-3′，下游引物5′-TTGCGGACAAGGAGCTGAAC-3′，擴增片段長度為68 bp；ICAM-1上游引物5′-AAACGGGAGATGAATGGT-3′，下游引物5′-TCTGGCGGTAATAGGTGTA-3′，擴增片段長度為184bp；VCAM-1上游引物5′-CCCTTGACCGGCTGGAGATT-3′，下游引物5′-CTGGGGGCAACATTGACATAAAGTG-3′，擴增片段長度為241 bp；GAPDH上游引物5-′CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′，下游引物5′-TAAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3′，擴增片段長度為151 bp。反應條件設定：94 ℃預變性10 min；然后94 ℃15 s，60 ℃ 60 s，45個循環結束。溶解程序：95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，然后RT-PCR SYBR Green檢測。處理組均設3個復管，取其CT值的均值。CT值代表反應管內熒光信號達到預設域值時所經歷的循環數，2-△△CT代表初始cDNA的相對量。

2結果

2.1CCK-8法檢測大鼠細胞增殖情況不同濃度ox-LDL(10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)作用于SVAREC細胞24 h后，SVAREC細胞隨著ox-LDL濃度升高，細胞生長抑制率升高，呈劑量依賴性，在相同時間下，與對照組比較，不同濃度的ox-LDL組間差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1、圖1。ox-LDL在終濃度為100 mg/L基礎上，分別加入不同濃度的Ang(1-7)(10-9mol/L～10-6mol/L)作用細胞24 h后，隨著Ang(1-7)濃度升高，細胞生長抑制率升高，呈劑量依賴性，不同濃度的ox-LDL組間差異有統計學差異(P<0.05)。詳見表2、圖2。

表1　不同濃度ox-LDL作用細胞24 h細胞增殖情況(±s)

圖1　不同濃度ox-LDL作用細胞24 h細胞增殖情況

組別劑量生長抑制率(%)對照組oxLDL(100mg/L)28.30±0.73實驗組oxLDL+Ang(17)(10-9mol/L)22.55±0.821)oxLDL+Ang(17)(10-8mol/L)18.29±0.691)oxLDL+Ang(17)(10-7mol/L)13.23±0.601)oxLDL+Ang(17)(10-6mol/L)9.47±1.011) 與對照組比較,1)P<0.05。

注：1.ox-LDL；2.ox-LDL+Ang(1-7)(10-9mol/L)；3.ox-LDL+Ang(1-7)(10-8mol/L)；4.ox-LDL+Ang(1-7)(10-7mol/L)；5.ox-LDL+Ang(1-7)(10-6mol/L)

圖2不同濃度Ang(1-7)作用細胞24 h細胞增殖情況

2.2實時定量PCR檢測LOX-1、ICAM-1、VCAM-1 mRNA SVAREC細胞經ox-LDL組(10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)和ox-LDL(100 mg/L)+Ang(1-7)(10-9mol/L～10-6mol/L)組處理24 h后，用Real-time PCR檢測基因LOX-1、ICAM-1、VCAM-1mRNA的表達水平。溶解曲線分析結果顯示LOX-1、ICAM-1、VCAM-1mRNA引物均可以擴增出單一的產物，且未出現其他明顯異常的波形，波形銳利，提示特異性較好(見圖3～圖5)。ox-LDL組處理SVAREC細胞24 h后，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1

mRNA表達量上升，與同時間對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)(見表3)。ox-LDL(100 mg/L)+Ang(1-7)(10-9mol/L～10-6mol/L)組處理24 h后，Ang(1-7)抑制ox-LDL的上述反應，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA表達量下降(見表4)。

圖3　 LOX-1溶解曲線

圖4　ICAM-1溶解曲線

圖5　VCAM-1溶解曲線

表3　 ox-LDL組作用SVAREC細胞24 h基因表達水平(±s)

表4　ox-LDL(100 mg/L)+Ang(1-7)組處理SVAREC細胞24 h基因表達量(±s)

3討論

動脈粥樣硬化的發生機制十分復雜，但目前公認內皮細胞的損傷和功能障礙是AS發生的始動因素和中心環節。血管內皮受多種因素的影響，尤其是氧化低密度脂蛋白、腎素-血管緊張素系統、氧化應激、同型半胱氨酸等。近年來，愈來愈多的研究提示ox-LDL誘發的內皮功能障礙加速AS的形成，增加了心肌缺血再灌注損傷和急性心肌梗死，成為目前心血管疾病領域的一個研究熱點。

LOX-1是主要存在于血管內皮細胞上的ox-LDL特異受體。在氧化應激的作用下，形成了比LDL具有更高細胞毒性的ox-LDL，與內皮細胞表面的受體LOX-1特異性結合后，經過內吞作用而損傷細胞，導致其內皮功能失調，使血管內皮細胞(VEC)生成一氧化氮合酶(NOS)減少，分泌的NO量減少，血管收縮，血小板和白細胞在內膜損傷處黏附、聚集和啟動，VSMC增殖和內膜異常增生。VEC受損后，脆性增加，滲透性和黏附性增強，大量LDL進入內膜下沉積，經氧化形成ox-LDL，導致惡性循環。研究發現，內皮細胞與ox-LDL一起培養24 h后，內皮細胞參與構成細胞骨架微絲的破壞、斷裂，這一作用導致內皮細胞間隙增大，通透性增加，有利于脂粒分子穿過內皮層進入內皮下，這也是導致AS形成機制之一。ox-LDL可通過降低內皮合成和釋放NO使AS中內皮細胞對凋亡敏感。LOX-1的激活與內皮細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞的凋亡均有關系，此過程是導致斑塊不穩定和急性冠脈綜合征發生的重要機制之一[6]。已有研究認為，ox-LDL與VEC間的是通過受體介導的。日本學者Swamura等1997年首先于牛主動脈內皮細胞上發現了LOX-1，它主要表達在及血管豐富組織的ox-LDL特異受體。在生理條件下LOX-1可以結合或吞噬已凋亡的細胞或者細菌等，發揮清道夫受體的功能；而在病理條件下，促炎因子、氧化應激、NO缺乏、流體剪切應力等多種刺激都可以誘導LOX-1介導內皮細胞對ox-LDL的吞納、降解及損傷作用[7]。

腎素-血管緊張素系統的過度激活在心血管病的發生、發展過程中有著十分重要的作用。目前研究發現Ang(1-7)具有擴張血管、降低血壓作用，抗血管再狹窄作用、抑制平滑肌細胞增殖，抗心肌肥厚、抑制心肌細胞肥大的作用，減輕心肌再灌流損傷和改善心肌梗死后心室重構，抗增殖以及利鈉、利尿，調節水、鹽及電解質平衡等作用。Loot等[8]對心力衰竭大鼠持續注射Ang(1-7)后發現，8周后就可以改善主動脈內皮功能，明顯增加了冠狀動脈血流量改善心臟功能。目前大量的循證醫學證明，ACEI具有保護血管內皮功能和心肌功能的作用，已經成為了治療心血管病的重要手段，它的作用可能是通過Ang(1-7)來實現，提示Ang(1-7)具有心肌和血管內皮的保護作用[9-10]。

本研究采用CCK-8和實時定量RT-PCR法從細胞和基因水平，觀察Ang(1-7)對ox-LDL誘導的大鼠主動脈內皮細胞LOX-1mRNA表達的影響。研究結果顯示隨著ox-LDL濃度的升高，ox-LDL可以呈劑量依賴性抑制SVAREC細胞的增殖，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA表達量上升，并呈劑量依賴性，給予不同濃度的Ang(1-7)干預后，隨著Ang(1-7)的濃度升高，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA表達量下降。本實驗從細胞和基因水平分別證實，Ang(1-7)可抑制內皮細胞LOX-1的表達，從而對內皮細胞可能起到保護作用。

本研究結果表明Ang(1-7)可抑制ox-LDL，從而顯示出其對血管內皮細胞可能具有保護作用，然而具體的作用機制有待進一步研究。

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(本文編輯薛妮)

Mechanisms of Angiotensin(1-7) on Aortic Endothelial Cell Injury Induced by Oxidized Low Density Lipoprotein in Rats

Du Ninghui，Yang Zhiming，Yang Huiyu

The Second Affiliated Clinical College，ShanXi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Abstract：Objective To investigate the effects of angiotensin (1-7) [Ang (1-7)] on expression levels of lectin like oxidized low-density lipoprotein receptor 1 (LOX-1)， intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1) in SV40-transformed aortic rat endothelial cells (SVAREC) induced by oxidized low density lipoprotein(ox-LDL)， and to explore its possible mechanism.MethodsCultured endothelial cells of rats were randomly divided into ox-LDL group and the ox-LDL+Ang-(1-7) group.The cell proliferation was detected by experimental Cell Counting Kit (CCK 8).The expression levels of LOX-1， ICAM-1， VCAM-1 mRNA were detected by fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method.ResultsOx-LDL could inhibit SVAREC cell proliferation in a dose-dependent manner， and there was statistically significant compared with the control group (P<0.05).Compared with control group，SVAREC cell growth inhibition rate was reduced in Ox-LDL+Ang(1-7) group.With the increase of ox-LDL concentration， LOX-1， ICAM-1 and VCAM-1 mRNA expression increased， and in a dose-dependent manner， and there was statistically significant compared with the control group(P<0.05).With the increase of Ang(1-7)， LOX-1， ICAM-1 and VCAM-1 mRNA expression decreased in Ox-LDL+Ang(1-7) group.ConclusionSVAREC ox-LDL can damage cells and LOX-1， ICAM-1 and increased VCAM-1mRNA expression and Ang(1-7) inhibition of ox-LDL of the reaction， and through the LOX-1， ICAM-1 and VCAM-1mRNA play a role.

Key words：angiotensin-(1-7)；oxidized low density lipoprotein； lectin like oxidized low-density lipoprotein receptor 1； SV40-transformed aortic rat endothelial cells； vascular cell adhesion molecule-1； intercellular adhesion molecule-1

通訊作者：楊志明，E-mail： duyu56@126.com

中圖分類號：R543.5R256.2.

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．08．011

文章編號：1672-1349(2016)08-0833-05

Corresponding Author：Yang Zhiming

(收稿日期：2015-09-12)