ERK抑制劑對1型糖尿病模型小鼠血管內損傷后內膜增生的抑制作用

王啟章，陳茂剛，徐格林，劉新峰

1.南方醫科大學南京臨床學院/南京軍區南京總醫院(南京 210002)；2.廣州醫科大學附屬深圳沙井醫院

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ERK抑制劑對1型糖尿病模型小鼠血管內損傷后內膜增生的抑制作用

王啟章1，2，陳茂剛1，徐格林1，劉新峰1

1.南方醫科大學南京臨床學院/南京軍區南京總醫院(南京 210002)；2.廣州醫科大學附屬深圳沙井醫院

摘要：目的探討細胞外信號調節激酶(ERK)特異性抑制劑PD98059對1型糖尿病模型血管內損傷后內膜增生的抑制作用。方法將實驗動物分為3組，假手術組，1型糖尿病模型血管內損傷組，PD98059干預組。各組小鼠于頸動脈損傷后第28天處死并取右頸總動脈，檢測頸動脈管腔面積、內膜面積、中膜面積及內膜/中膜面積比(I/M)。免疫組化檢測內膜抗磷酸壓ERK(p-ERK)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達水平。結果與假手術組相比，1型糖尿病模型血管內損傷組術后28 d，管腔面積明顯縮小，內膜面積、中膜面積及I/M明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)，頸動脈血管內膜p-ERK及MMP-9水平也明顯增強(P<0.01)。PD98059干預組術后28 d，與1型糖尿病模型血管內損傷組相比，管腔面積明顯增加，內膜面積、中膜面積及I/M明顯降低(P<0.01)，頸動脈內膜MMP-9表達明顯減低，血脂及血糖水平無統計學意義。結論ERK抑制劑可能通過抑制MMP-9減輕1型糖尿病高膽固醇飲食模型頸動脈血管內損傷后內膜增生。

關鍵詞：糖尿病；細胞外信號調節激酶；基質金屬蛋白酶-9；血管內損傷；內膜增生；小鼠

頸動脈內膜剝脫及頸動脈支架術后內膜增生影響病人的遠期預后，糖尿病病人發生率更高。關于頸動脈血管內損傷后內膜增生的確切機制沒有統一結論，因而針對內膜增生原因行相應的靶向性干預治療成為難點。細胞外信號調節激酶(ERK)是一種絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，在內膜增生過程中發揮重要作用[1]。本研究利用1型糖尿病內膜增生模型，探討 ERK抑制劑對尿病高脂飲食小鼠血管內損傷后內膜增生的抑制作用，并探討頸動脈損傷后內膜增生的可能機制。

1材料與方法

1.1材料本實驗動物均為C57BL/6品系小鼠，周齡為8周。清潔級雄性INS2AKITA小鼠(突變型)12只及同窩出生的野生型C57BL/6雄性小鼠6只，由南京大學模式動物研究所提供，許可證號：SCXK(蘇)2010-0001。羊抗兔二抗購自美國CST公司。PD98059(ERK特異性抑制劑)購自美國Tocris Bioscience公司。免疫組織化學SP試劑盒購自福州邁新生物科技有限公司。基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)購自美國Abcam公司。高膽固醇飼料購自江蘇協同醫藥生物工程有限公司，飼料配方為： 基礎飼料87.5%；膽固醇2%；豬油10%；膽酸鈉0.5%。

1.2實驗動物與分組以INS2AKITA小鼠(是近年來發現的基因突變型1型糖尿病模型)為實驗動物模型。小鼠分為3組，每組6只，周齡均為8周。第1組為假手術組：C57BL/6野生型雄性小鼠，普通飼料飲食，喂養8周后行分離右側頸總動脈，分離結束后縫合皮膚。第2組為糖尿病鼠頸動脈損傷組：INS2AKITA雄性小鼠，高膽固醇飼料飲食，喂養8周后行右側頸動脈血管內損傷；損傷開始每日腹腔注射二甲基亞砜(DMSO) 30 μL，直至處死。第3組為PD98059干預組：INS2AKITA雄性小鼠，高膽固醇飼料飲食，喂養8周后行右側頸動脈血管內損傷；損傷開始每日腹腔注射PD98059 30 mg/kg，直至處死。PD98059均用0.1%DMSO溶解。所有小鼠自由飲食水，單籠飼養，室溫20 ℃～25 ℃。均按分組條件喂養8周后，清晨麻醉處死前采血2 mL。麻醉處死后，立即取雙側頸總動脈，左側頸總動脈放入4%多聚甲醛固定；右側頸總動脈放入凍存管，-80℃保存。

1.3頸動脈血管內探針損傷過程戊巴比妥鈉腹腔注射(0.5 mL/kg)麻醉后，仰位固定在手術臺上。于無菌條件下逐層分離皮下組織，暴露氣管。于氣管左側尋找右頸總動脈，將頸外動脈遠心端用絲線結扎，用顯微止血夾分別夾住頸總動脈近心段及頸內動脈；用顯微剪將頸外動脈結扎近端剪一小切口；左手用顯微鑷將切口上端輕微拉起，右手將探針沿切口從頸外動脈管腔進入到頸總動脈近心端，將探針沿頸總動脈分別向上、下、左、右四個方向各來回抽拉3次。拔出探針，在頸外動脈近心端用絲線結扎。緩慢松開頸總動脈及頸內動脈顯微止血夾。觀察有無出血。于傷口涂撒少許青霉素粉末，縫合傷口。放入25 ℃恒溫層流室，單籠喂養，每半小時觀察小鼠狀態，并于3 h后小鼠唇邊喂水。所有小鼠術后均存活。各組繼續按原來飼料喂養。各組小鼠于頸動脈損傷后第28天清晨麻醉處死。處死前均抽血1 mL。處死后立即分離右側頸總動脈，并取出頸總動脈放入4%多聚甲醛固定。

1.4檢測血糖、血清三酰甘油(TG)及總膽固醇(TC)水平采用生化法檢測血糖；采用日本Olympus Type AU2700自動生化分析儀檢測血清TG及TC水平。

1.5頸動脈管腔面積、內膜面積、中膜面積、內膜/中膜面積比(I/M)檢測右側頸總動脈4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋，制成3 μm厚橫斷面切片，行HE染色。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測頸動脈管腔面積、內膜面積、中膜面積及I/M。

1.6免疫組織化學染色檢測頸動脈內膜p-ERK(ERK的活化表現形式)及MMP-9水平將石蠟切片放入60 ℃烤箱，60 min；脫蠟，水化，抗原修復后滴加一抗，滴加二抗，繼而行DAB顯色； 復染，脫水，封片：中性樹膠；采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對檢測頸動脈內膜p-ERK，MMP-9表達進行半定量。棕褐色為陽性表達。以平均光密度乘以陽性面積比即積分光密度值表示每張切片的陽性蛋白表達的相對含量。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野后取平均值。

2結果

2.1各組血糖及血脂(TC、TG)水平與假手術組相比， 糖尿病鼠頸動脈損傷組血糖明顯增高(P<0.01)。而與糖尿病鼠頸動脈損傷組相比， PD98059干預組血糖無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1　各組小鼠血糖、TG及TC比較(±s) 　mmol/L

2.2各組小鼠頸動脈組織形態學比較與假手術組相比，糖尿病鼠頸動脈損傷組術后28 d，管腔面積明顯縮小，內膜面積、中膜面積及I/M明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見表2、圖1。

PD98059干預組術后28 d，與糖尿病鼠頸動脈損傷組相比，管腔面積明顯增加，內膜面積、中膜面積及I/M明顯降低(P<0.01)。

表2　各組實驗小鼠頸總動脈管腔面積、內膜面積、中膜面積及比較(±s)

注：A為假手術組；B為內膜增生模型組；C為PD98059干預組。

2.3各組小鼠頸動脈內膜MMP-9水平的影響小鼠頸動脈內膜MMP-9水平分別為：假手術組5.21±1.21，糖尿病鼠頸動脈損傷組28.22±6.57， PD98059干預組11.10±2.51。在糖尿病鼠頸動脈損傷組，與假手術組相比，術后28 d頸動脈血管內膜MMP-9表達水平明顯增強(P<0.01)。而與糖尿病鼠頸動脈損傷組相比，PD98059干預組頸動脈內膜MMP-9水平明顯下降(P<0.05)。詳見圖2。

圖2免疫組化檢測各實驗組小鼠頸動脈內膜的MMP-9表達(×200)

2.4各組頸動脈內膜ERK比較小鼠頸動脈內膜ERK分別為：假手術組5.28±2.36，糖尿病鼠頸動脈損傷組23.56±3.54，PD98059干預組8.79±3.68。與假手術組相比，糖尿病鼠頸動脈損傷組術后28 d頸動脈血管內膜p-ERK明顯增強(P<0.01)，而與糖尿病鼠頸動脈損傷組相比，p-ERK干預組頸動脈內膜p-ERK水平明顯下降(P<0.01)。

3討論

1型糖尿病屬于胰島素依賴型糖尿病，可發生于各年齡段，以兒童和青少年為主。由于胰島素及降糖藥物的普及，1型糖尿病病人生存率及生存質量明顯提高，關于1型糖尿病病人動脈硬化及內膜增生的資料尚少，但是隨著1型糖尿病病人步入成年或老年化，飲食結構的變化，往往會出現胰島素抵抗或高脂血癥[2]，因此，探討1型糖尿病病人血管內損傷后內膜是否增生以及增生的機制具有重要的意義。

本研究中INS2AKITA小鼠模型，是一種位于7號染色體的Ins2Akita等位基因突變形成自發性的雜合子1型糖尿病小鼠，與人類1型糖尿病發病機制較類似。本研究顯示，將INS2AKITA 給予高膽固醇飲食，再進行頸動脈血管內損傷，較假手術組相比，可見明顯的內膜增生，表明實驗建立的1型糖尿病頸動脈損傷的內膜增生模型建立成功，為糖尿病頸動脈損傷后內膜增生研究奠定良好的基礎。

ERK信號轉導通路是MAPK 超家族中重要的傳導通路之一，ERK通過磷酸化“瀑布樣”級聯反應，將細胞外信號跨膜轉導至細胞內，導致生物學效應，參與調節細胞的增殖、分化、和組織浸潤，與腫瘤、子宮內膜及血管等組織的增殖、增生有有關。研究顯示ERK信號參與多種細胞(包括腫瘤細胞及血管平滑肌細胞等)的增生過程[3]。Zhang等[4]研究顯示，脂聯素通過線粒體融合蛋白-2介導的Ras-Raf-Erk1 / 2的信號級聯傳導途徑的調制影響血管平滑肌細胞增殖和凋亡。本研究顯示，抑制血管內膜p-ERK表達可抑制血管內中膜面積及I/M，減輕管腔狹窄，給予ERK抑制劑后，內膜MMP-9表達明顯降低。MMP-9由體內多種細胞如單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞等產生，是依賴鋅離子而降解各種細胞外基質的蛋白酶，MMP-9活化可降解細胞外基質，促進血管內膜組織重構，金屬蛋白酶造成內彈力層間隙增寬，血管平滑肌細胞從中膜通過內彈力層遷移到內膜。因此，MMP-9表達上調是內膜增生及細胞增殖過程中的重要炎性介質。在星型膠質瘤細胞，鱗狀上皮癌細胞中均發現ERK信號轉導途徑誘導的MMP-9表達增強[5-6]。另有研究顯示，G蛋白偶聯受體激酶結合蛋白-1在肝細胞癌中通過激活ERK/MMP-9信號促進腫瘤進展[7]。說明ERK/MMP-9通路在細胞增殖過程中起到重要作用。

雖然實驗研究結果表明ERK抑制血管內損傷后內密增生，但是藥物在體內的代謝十分復雜，因此需行體外研究進一步證實藥物對培養的平滑肌細胞增殖及遷移是否有影響。由于小鼠頸動脈體積很小，損傷的頸動脈提取的蛋白及mRNA有限，不能利用westernblot及RT-PCR檢測整個頸動脈的炎癥因子基因及蛋白表達，利用免疫組織化學方法，定位內膜，更準確的檢測小鼠血管內損傷后頸動脈內膜的MMP-9的表達水平。并且由于INS2AKITA小鼠樣本量有限，僅研究頸動脈損傷后28 d該模型小鼠內膜增生的變化情況，對其損傷后1周～2周、3個月及半年后的內膜增生變化尚需進一步研究。

本實驗表明， ERK抑制劑可減輕1型糖尿病高膽固醇飲食模型頸動脈血管內損傷后內膜增生；ERK抑制劑可能通過抑制MMP-9等抑制血管平滑肌細胞增生來減輕內膜增生。體內研究和臨床試驗有待于進一步證實特異性ERK抑制劑對糖尿病病人血管內損傷后內膜增生的醫治作用。

參考文獻：

[1]Yang D，Wang LL，Dong TT，et al.Progranulin promotes colorectal cancer proliferation and angiogenesis through TNFR2/Akt and ERK signaling pathways[J].Am J Cancer Res，2015，5(10)：3085-3097.

[3]Huang YC，Pan M，Liu N，et al.Effects of nuclear factor-κB and ERK signaling transduction pathway inhibitors on human melanoma cell proliferation in vitro[J].Oncol Lett，2015，10(5)：3233-3237.

[4]Zhang W，Shu C，Li Q，et al.Adiponectin affects vascular smooth muscle cell proliferation and apoptosis through modulation of the mitofusin-2-mediated Ras-Raf-Erk1/2 signaling pathway[J].Mol Med Rep，2015，12(3)：4703-4707.

[5]Kim JH，Choi C，Benveniste EN，et al.TRAIL induces MMP-9 expression via ERK activation in human astrocytoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2008，377(1)： 195-199.

[6]Kaomongkolgit R，Cheepsunthorn P，Pavasant P，et al.Iron increases MMP-9 expression through activation of AP-1 via ERK/Akt pathway in human head and neck squamous carcinoma cells[J].Oral Oncol，2008，44(6)： 587-594.

[7]Chen J，Yang P，Yang J，et al.GIT1 is a novel prognostic biomarker and facilitates tumor progression via activating ERK/MMP9 signaling in hepatocellular carcinoma[J].Onco Targets Ther，2015，8：3731-3742.

(本文編輯薛妮)

Inhibition Effect of ERK Inhibitor on Intimal Hyperplasia after Carotid Endovascular Injury in Type 1 Diabetes Model

Wang Qizhang， Chen Maogang， Xu Gelin， Liu Xinfeng

Jinling Hospital，Southern Medical University， Nanjing 210002， Jiangsu， China； Shenzhen Shajing Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Shenzhen 518104， Guangdong， China

Abstract：Objective To investigate the inhibition effect of extracellular signal-regulated kinase(ERK) inhibitor on intimal hyperplasia after carotid endovascular injury.MethodsThe mice were divided into 3 groups： sham operation group，model group(type 1 diabetes model underwent damage of right common carotid artery)， PD98059 treatment group.HE staining was performed in carotid artery and Image Pro Plus 6.0 image analysis software was used to measure the lumen area， intimal area， medial area and intima/media area ratio (I/M).Immunohistochemical staining was performed to detect the expressions of p-ERK and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in carotid intima.ResultsCompared with sham operation group， the lumen area was decreased， the intimal area， medial area and I/M，the expressions of p-ERK and MMP-9 in carotid intima were significantly increased at 28 days after procedure in model group(P<0.01).Compared with model group，the lumen area was increased， the intimal area， medial area and I/M were decreased at 28 days after procedure in PD98059 treatment group(P<0.05).The expressions of p-ERK and MMP-9 were suppressed， but there was no statistical change for serum glucose， triglyceride (TG)， total cholesterol (TC) in PD98059 treatment group.ConclusionERK specific inhibitor can inhibit MMP-9 expression，and suppress intimal hyperplasia after carotid endovascular injury in type 1 diabetes mice with high cholesterol diet.

Key words：diabetes； extracellular signal-regulated kinase； matrix metalloproteinase-9； endovascular injury； intimal hyperplasia；mice

基金項目：國家自然科學基金(No.81501193)；江蘇省自然科學基金(No.BK20141373)

通訊作者：劉新峰， E-mail：wqzflm@163.com

中圖分類號：R587R255

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．08．012

文章編號：1672-1349(2016)08-0837-04

Corresponding Author：Liu xinfeng(Jinling Hospital，Southern Medical University， Nanjing 210002， Jiangsu， China)

(收稿日期：2015-07-01)