沉默NOX1表達對A549細胞增殖的影響>*

徐小艷，王曉衛，闕菡雅，王　娜，夏艷秋，薛　騰，燕　貞，周　舫#

1)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室 鄭州 450001　2)周口職業技術學院衛生保健教研室 周口 466000　3)鄭州市疾病預防控制中心公共衛生科 鄭州 450000

沉默NOX1表達對A549細胞增殖的影響>*

徐小艷1)，王曉衛2)，闕菡雅3)，王娜1)，夏艷秋1)，薛騰1)，燕貞1)，周舫1)#

1)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室 鄭州 4500012)周口職業技術學院衛生保健教研室 周口 4660003)鄭州市疾病預防控制中心公共衛生科 鄭州 450000

關鍵詞A549細胞;ROS;NOX1;凋亡

摘要目的：探討NOX1對肺癌A549細胞凋亡和增殖的影響。方法：通過瞬時轉染技術轉染特異性的NOX1小干擾RNA(siRNA)，按轉染情況分為Mock組、NC組、FAM-NC-NOX1 siRNA組，轉染12 h后采用Western blot檢測NOX1蛋白的表達，通過熒光探針DCFH-DA檢測細胞ROS水平,流式細胞儀檢測細胞增殖活性和凋亡率。結果：siRNA轉染12 h以上，轉染率穩定在80%以上，NOX1蛋白的表達量與Mock組相比下降(P<0.05)；與Mock組相比， FAM-NC-NOX1 siRNA組細胞在24、36、48 h的增殖活性均下降，ROS水平也下降(P<0.05)。結論：NOX1 siRNA轉染A549細胞能有效抑制細胞的增殖。

國際癌癥研究中心報告[1]顯示：世界范圍內發病率和病死率最高的癌癥依然是肺癌，僅僅2012年全球新增肺癌患者約180萬，約159萬人死亡，中國所占的比例為1/3以上。腫瘤發生時，機體發生一系列的改變，腫瘤細胞的生長均需要活性氧(reactive oxygen species,ROS)的參與[2]，一些腫瘤的治療手段也是通過改變ROS水平來達到治療目的[3]。NADPH氧化酶NOX家族是ROS的主要來源[4-5]。肺組織中NOX家族成員有不同程度的表達，其中NOX1的表達量在肺癌組織中高于正常組織[6]。A549細胞為人肺腺癌細胞,可以以穩定的形式傳代培養[7-8]，因此選取A549細胞用于該研究，通過觀察NOX1在A549細胞增殖與凋亡中的作用，為肺癌的治療提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料A549細胞購自中科院上海細胞生物研究所，NOX1小干擾RNA(siRNA)為上海吉瑪制藥有限公司提供，Sunriseremote酶標儀購于奧地利TECAN公司，DYCZ-24DN電泳儀購于北京市六一儀器廠，流式細胞儀購于美國BD公司，細胞凋亡檢測試劑盒購于德國美天妮公司，無支原體胎牛血清購于美國Gemini公司，RPMI 1640培養基購于北京索萊寶科技有限公司。所使用的siRNA核苷酸序列見表1。

表1　siRNA核苷酸序列

1.2NOX1 siRNA的轉染選取生長狀態良好的細胞進行NOX1 siRNA的轉染，轉染前24 h將細胞密度調整到0.8×105～1.0×105mL-1后接種至6孔板，每孔加2 mL 細胞懸液，采用Lipofectamine2000轉染試劑轉染NOX1 siRNA至A549細胞中。設置Mock組、NC組和FAM-NC-NOX1 siRNA組，其中Mock組只加轉染試劑，NC組轉染NC-NOX1 siRNA，FAM-NC-NOX1 siRNA組轉染FAM-NC-NOX1 siRNA。嚴格按照說明書轉染步驟操作。重復測定3次，確定轉染條件使其轉染率能穩定在80%以上。

1.3Western blot檢測NOX1蛋白的表達轉染24 h后，提取各組總蛋白，調整上樣量為每組25 μg，按比例稀釋蛋白樣品和上樣緩沖液后95 ℃ 5 min。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后用50 g/L脫脂奶液37 ℃封閉2 h，TBST洗3次，每次10 min，一抗過夜后TBST洗3次，然后加二抗37 ℃孵育2 h，再次TBST洗3次后，加入適量ECL發光液，用Image600進行曝光、測定。實驗重復3次。

1.4細胞增殖活性測定調整A549細胞密度至5×104mL-1，接種至96孔板，每組5個復孔，每孔加細胞懸液200 μL，放入CO2恒溫培養箱中培養。轉染后12、24、36、48 h,加入20 μL稀釋好的MTT 溶液，CO2恒溫培養箱中繼續孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加150 μL的DMSO，勻速搖晃10 min，用酶標儀檢測492 nm處各孔吸光度值。

1.5DCFH-DA法檢測細胞內ROS水平利用熒光探針DCFH-DA進行A549細胞ROS的檢測。調整細胞密度為1.0×105mL-1，按照實驗分組將A549細胞培養于6孔板中，轉染48 h后，按DCFH-DA終濃度為10 μmol/L加樣；把細胞清洗并消化后，用稀釋好的探針重懸細胞，置于37 ℃細胞培養箱中孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻一次，使探針與細胞充分接觸；用PBS洗滌細胞3次，以除去未進入細胞的DCFH-DA；用0.5 mL 的PBS重懸細胞，用流式細胞儀488 nm激發波長、525 nm發射波長，FL1收集DCF的熒光信號,根據收集的熒光信號所在的峰位置及大小表示ROS表達的水平。實驗重復3次。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡率各組細胞轉染48 h后，將細胞消化，加入Binding Buffer 1 mL，1 000 r/min離心,重復1次。加入Binding Buffer 100 μL吹打混勻,加入10 μL Annexin V-FITC避光混勻后放置15 min。用500 μL Binding Buffer重懸細胞后加入5 μL PI，立即上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0對數據進行統計學分析。不同組間NOX1相對表達量和ROS水平以及凋亡率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1A549細胞轉染NOX1 siRNA的轉染率轉染12 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉染FAM-NC-NOX1 siRNA的A549細胞，結果見圖1。

A：Mock組；B：NC組；C：FAM-NC-NOX1 siRNA組。圖1　瞬時轉染12 h后熒光顯微鏡下的A549細胞(×200)

2.2抑制NOX1表達后A549細胞增殖活性的改變結果見圖2。

-◆-:Mock組；-■-：NC組；-▲-：FAM-NC-NOX1 siRNA組。圖2　轉染后不同時間各組細胞的吸光度值

2.3不同處理組A549細胞ROS水平、NOX1相對表達量及凋亡率的比較結果顯示，FAM-NC-NOX1 siRNA組NOX1蛋白表達低于Mock組和NC組；與Mock組和NC組相比， FAM-NC-NOX1 siRNA組ROS水平下降；3組之間凋亡率比較，差異無統計學意義。見圖3、表2。

1：Mock組；2：NC組；3：FAM-NC-NOX1 siRNA組。圖3　Western blot檢測各組A549細胞NOX1蛋白的表達

組別ROS水平NOX1相對表達量凋亡率/%Mock組524.00±31.651.00±0.023.57±0.26NC組472.33±29.860.92±0.052.90±0.17FAM-NC-NOX1siRNA組180.16±25.60*0.28±0.03*3.90±0.35F48.089350.9523.756P<0.001<0.0010.110

*：與Mock組和NC組相比，P<0.05。

3討論

隨著人們生活水平的提高，環境污染的加劇，生活壓力的加大，腫瘤的發病率也在上升，其中肺癌尤為明顯。研究[2,9-11]表明，肺癌的發生發展過程與ROS有著密切的聯系，且目前已經明確的化學致癌物、電離和紫外輻射均能使細胞內的ROS水平升高，許多原發性腫瘤和細胞系的ROS水平均高于正常組織的表達水平。

研究[12]表明，NOX1和腫瘤的發生密切相關。Suh等[13]首次將NOX1質粒轉染至無胸腺的小鼠后小鼠表皮形成了腫瘤，這就表明其具有促進腫瘤生成的可能，所以該實驗選擇觀察NOX1抑制對A549細胞凋亡和增殖的影響。結果顯示，細胞轉染率穩定在80%以上，說明NOX1 siRNA成功導入到了A549細胞中；另外，FAM-NC-NOX1 siRNA組NOX1蛋白的表達水平明顯下降，說明實驗選取的NOX1干擾序列沉默效果良好，可以有效抑制NOX1的表達。

NOX1 siRNA成功抑制A549細胞NOX1的表達后，用MTT法檢測細胞的增殖活性，發現NOX1被抑制24、36、48 h后細胞的增殖活性均下降，但是在12 h時增殖活性并無變化，說明在24 h后才能抑制A549細胞的增殖活性，所以之后的實驗中選擇了NOX1 siRNA轉染24 h后觀察細胞。ROS在肺部腫瘤的各個階段均發揮作用，在腫瘤的形成階段，ROS可能激活了原癌基因如c-Jun和c-Fos,而c-Jun的過表達與肺癌有著直接的關系[14]。為了觀察NOX是否通過產生ROS來影響A549細胞的增殖活性，作者選用DCFH-DA法檢測ROS水平，從結果可以看出ROS水平和細胞增殖活性的變化趨勢是一致的，說明NOX1可能通過調節ROS水平來調節A549細胞的增殖活性。

為了探討NOX1抑制對A549細胞凋亡的影響，作者采用流式細胞儀來檢測細胞凋亡率，從結果可以看出，細胞的凋亡并未發生變化。一般來說，細胞增殖活性的降低伴隨著凋亡的升高，但是該結果顯示NOX1表達量及ROS水平的下降使細胞增殖活性下降，但并未能促進A549細胞凋亡率的增加。這可能是由于ROS水平下降后，使其細胞周期受到阻滯，從而導致其增殖活性的下降，而降低后的ROS水平仍足以支持A549細胞的存活，且在A549細胞中NOX家族的其他成員均有表達，可能其之間存在交互作用，共同調控細胞的凋亡通路。

綜上所述，NOX1 siRNA可以有效抑制NOX1的表達，NOX1表達受抑制后，隨著A549細胞中ROS水平的下降，細胞的增殖活性也下降，但是細胞凋亡水平未發生改變，其機制尚未明確，需要進一步研究證實。

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Effect of silencing NOX1 on proliferation of A549 cells

XUXiaoyan1),WANGXiaowei2),QUEHanya3),WANGNa1),XIAYanqiu1),XUETeng1),YANZhen1),ZHOUFang1)

1)DepartmentofOccupationalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofHygiene,ZhoukouVocationalandTechnicalCollege,Zhoukou4660003)DepartmentofPublicHealth,CenterforDiseasePreventionandControlofZhengzhou,Zhengzhou450000

Key wordsA549 cell;ROS;NOX1;apoptosis

AbstractAim: To explore the proliferation and apoptosis in A549 cells after down-regulating NOX1 expression.Methods: NOX1 interference in A549 cells was achieved by NOX1 small interference RNA(siRNA). A549 cells were allocated into Mock group, NC group, and FAM-NC-NOX1 siRNA group. Being transfected specifically through the transient transfection technology about 12 h,the expression of NOX1 protein was detected by Western blot,then the fluorescent probe DCFH-DA was used to detect the ROS levels of cells,the flow cytometry was used to detect the changes of cell proliferation activity and apoptosis.Results: The transfection efficiency of NOX1 siRNA was above 80% in A549 cells. Compared with the Mock group,NOX1 protein expression was decreased, the cell viability was decreased at 24, 36, 48 h after transfection,and the ROS level in FAM-NC-NOX1 siRNA group was decreased(P<0.05).Conclusion: NOX siRNA transfection could effectively inhibit the proliferation of A549 cells.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.011

#通信作者，女，1974年7月生，博士，教授，研究方向：職業腫瘤和應激醫學，E-mail：zhoufang23@sina.com

中圖分類號R730.1

*河南省高等學校重點科研項目16A330008